分光光度法50管/48样
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
NOX(EC1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生,而且与免疫反应密切相关。
测定原理:
NOX能够将NADH氧化为NAD,NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP,在nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
试剂的组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存。
试剂二:液体10mL×1瓶,-20℃保存。
试剂三:液体1mL×1瓶,-20℃保存。
试剂四:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂五:液体6mL×1瓶,4℃保存。
试剂六:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
准确称取0.1g组织或收集万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
将匀浆g,4℃离心5min。
弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,g,4℃离心10min。
上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的NOX(此步可选做)。
步骤④中的沉淀即为线粒体,加入uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于NOX活性测定。
血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
分光光度计预热30min以上,调节波长至nm,蒸馏水调零。
样本测定
(1)试剂四、试剂五和试剂六于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在1mL石英比色皿中加入40μL样本、μL试剂四、μL试剂五和μL试剂六,混匀,记录nm处20s时吸光值A1和1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
NOX活力单位的计算
1、血清(浆)NOX活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每分钟A变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mL)=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mgprot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T=2×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟A变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/g鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX(U/cell)=ΔA×V反总÷(×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反总:反应体系总体积,1mL;V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,0.mL;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;:细胞或细菌总数,万。
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