分光光度法50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生
途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中
发挥重要作用。
测定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3
二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，nm处测定NADH的减少
量可反映GADPH活性的高低。
需自备的仪器和用品
分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂的组成和配制
提取液一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体28μL×1支，4℃保存；
组织样本的前处理
①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，g离心10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。
建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。
细菌或培养细胞的前处理
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（个）：提取液一体积（mL）为~：1的比例（建议万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或W，超声3s，间隔10s，重复30次）；g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在试剂三中加入1mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（3）在1mL石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
GAPDH活性计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(W×V样÷V样总)÷T=×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(×V样÷V样总)÷T=2.×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；：细菌或细胞总数，万。