3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒(紫外分光光度法)
产品货号:BA
产品规格:25管/24样/50管/48样
产品简介:
GAPDH(EC1.2.1.12)催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、无机磷和NAD+,nm处测定NADH的减少量可反映GAPDH活性的高低。注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
溶液的配制:
1、试剂三:液体置于试剂瓶内EP管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为3:的体积比例充分混匀,现用现配。
2、工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,根据需要取一定的量37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤(仅供参考):
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(个):提取液体积(mL)为~0:1的比例(建议万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或W,超声3s,间隔10s,重复30次);g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
1.分光光度计预热30min以上,调节波长至nm,蒸馏水调零。
2.操作表:在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂:
三、GAPDH酶活计算
1.按样本蛋白浓度计算
酶活定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活(U/mgprot)=ΔA÷(ε×d)××V反总÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
2.按样本质量计算
酶活定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)××V反总÷(V样×W÷V样总)÷T
=×ΔA÷W
3.按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活(U/cell)=ΔA÷(ε×d)××V反总÷(×V样÷V样总)÷T
=2.14×ΔA
4.按照血清(浆)体积计算
酶活定义:每mL样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)××V反总÷V样÷T
=×ΔA
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.L;V样:反应体系中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:5min;:细菌或细胞总数,万;:单位换算系数,1mol=nmol
注意事项:
1.当A1小于0.8或ΔA大于0.7时,建议将样本稀释后再进行测定。
2.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。