硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶。其催化的反应方程如下：
硝酸还原酶是个诱导酶。在取材的前一天加50mmol/LKNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
1.仪器设备
高速离心机、分光光度计、部分收集器、研钵等。
2.操作方法
1）酶的粗提液：材料可用植物的叶、茎、根，发芽的种子，离体胚和培养的细胞等，以发芽3～5d的小麦幼苗叶片提取较为简便。剪取材料，洗净吸干并切成小块、放在研钵中冷冻30min后加入少许石英砂及磷酸缓冲提取液（25mmol/L磷酸缓冲液加1mmol/LEDTA和10mmol/L半胱氨酸，pH8.8），研磨成匀浆（材料多时可用捣碎机），匀浆用2层纱布过滤，清液用×g离心15min，得到的上清液即为酶的粗提液。整个过程必须在4℃下进行。
2）酶的活性测定：吸取0.5mlKNO3溶液、0.3mlNADH和0.2ml酶粗提液。混合后在25℃下保温30min。保温结束后，立即加入0.5ml1%氨基苯磺酰胺和0.5ml萘基乙烯二胺水溶液。静置15min以上，用分光光度计在mm处测定光吸收。以不加NADH的（加入0.3ml水）作空白对照。
样品的光吸收减去空白对照的光吸收等于光吸收的增量。光吸收的增加即此1ml反应液中，在保温30min内，由于酶的作用而增加的NO2-数量。从标准曲线中计算该光吸收的增量相当于多少微克的NO2-。
3）酶的纯化：硝酸还原酶易于失活，近年来常用亲和层析法进行纯化。在粗酶液中加入固体（NH）2SO4，达到20%饱和度，调pH至7.5，置于4℃下15min，×g离心15min，弃去沉淀。上清液中再加入固体（NH）2SO4到40%饱和度，4℃下放30min。再用×g离心15min，弃去上清液。将沉淀物溶解在小量的磷酸钾缓冲液中（25mmol/L，pH7.5）。然后用BlueDextranSepharose进行亲和层析。此外，也可直接用粗酶液上亲和层析柱。
（1）BlueDextranSepharose的制备：试剂：2mol/L碳酸钠（pH11.4），0.1mol/L碳酸氢钠（pH9.5），0.5mol/LTris缓冲液（pH8.0），0.mol/LTris缓冲液（pH8.5），0.4mol/L碳酸氢钠（pH10），0.1mol/L柠檬酸-氢氧化钠和1mol/LKCl（pH4.0），0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠和1mol/LKCl（pH8.0），Sepharose4B（琼脂糖40%），溴化氰10g溶解于乙腈5ml或10ml二甲基甲酰胺中（现用现配，溴化氰有毒，易挥发，操作时要注意安全），1gBlueDextran溶于ml的0.4mol/L碳酸氢钠（pH10），洗脱液A：25mmol/L磷酸缓冲液，含5mmol/LEDTA和5mmol/LL-半胱氨酸，pH7.5；洗脱液B：25mmol/L磷酸缓冲液，含5mmol/LEDTA和5mmol/LL-半胱氨酸以及μmol/LNADH，pH7.5。
（2）制备步骤：将mlSepharose4B置于3号砂芯漏斗上抽干后，取约50g，用0ml蒸馏水洗涤抽干，倒出并悬浮于2mol/L碳酸钠（pH11.4）中。搅拌移至通风橱内，将含10g溴化氰的乙腈溶液慢慢加入（在冰浴中），电动搅拌15min。倒入砂芯漏斗，用0ml冰冷蒸馏水洗涤。然后依次用ml冰冷的0.mol/LTris缓冲液（pH8.5）和0ml冰冷的0.1mol/L碳酸氢钠（pH9.5）洗涤，抽干。立即移入1gBlueDextran的碳酸氢钠溶液中，在4℃下电动搅拌20h。在砂芯漏斗上用ml冰冷的蒸馏水洗净后，悬浮在20ml的0.5mol/LTris缓冲液（pH8.0）作用2h。然后连续用0ml0.1mol/L柠檬酸-氢氧化钠含1mol/LKCl（pH4.0）混合液和0ml0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠含1mol/LKCI（pH8.0）混合液洗涤。洗涤液在nm处达最低光吸收值，即可上柱备用。
（3）亲和层析：层析柱为14×1.9cm，上柱量为10ml，上样时流速要慢。样品流完后，用ml洗脱液A洗去粗提液中的杂蛋白。然后更换洗脱液B，流速也改为1ml/min。由于B液中含有NADH，能把吸附在柱上的硝酸还原酶洗脱下来。洗脱下来的溶液，经部分收集器，分装在试管中，每管2ml。将各管中的样品，立即进行硝酸还原酶活力测定。然后再用Lowry法测定各样品中的蛋白质含量。全部过程在4℃下进行。
酶的纯度以酶活力单位（U）/mg蛋白计量，一般以产生1molNO2-/30min为1单位。
3.注意事项
1）光对硝酸还原酶有明显影响，组织和细胞的年龄对酶活力也有影响，因此取材时必须注意。
2）硝酸还原酶是以NADH或NADPH为氢供体的，随提取材料不同而异，如链孢霉菌的硝酸还原酶以NADPH为氢供体，而禾谷类作物一般都利用NADH。
3）近年来活体测定法也常被采用，但其缺点是重复性不够理想。
4）80年代，LucStreit等（PlantPhysiol.，81：）从野生型大豆及其突变体比较中发现一种非诱导硝酸还原酶（constitutivenitratereductase，CNR），并据此认为大豆中硝酸还原酶有三种同工酶。两种是非诱导酶（CNR），它们在反应中的电子供体分别为NADPH：NR（C）NR，pH6.5）和NADH：NR（C）NR，pH6.5）。第三种是诱导酶，其电子供体为NADH：NR（iNR，pH7.5）。前二者只有在以尿素为氮源培养的大豆叶片中才有，此种大豆的叶片中不含iNR.而以硝酸盐为氯源培养的大豆叶片中同时含有CNR和iNR。CNR存在于幼嫩叶片中，iNR则在完全展开的叶片中活性最高。CNR活性至峰值时，iNR活性出现，下降时，iNR活性上升。无论是以钼为金属辅基，还是以钨取代钼的iNR（通过钼酸盐或钨酸盐培养得到的），均可测到iNR活性，而CNR活性只有以钼为金属辅基时才可以测得。CNR和iNR的共辅因子彼此不能互补重组活性，显示两者共辅因子在结构上可能有异。根据上述，所以在测定大豆的硝酸还原酶活性时，应考虑到非诱导硝酸还原酶的存在及其取材的培养背景和所需的反应条件。测定CNR活性时毋须像iNR那样要进行诱导。至于测定其活性（invi-vo/invitro）方法中的其他具体流程则和本节方法中的iNR相同（此点由李止正补充——编者）。
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