糖原磷酸化酶a（GPa）检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
糖原磷酸化酶（Glycogenphosphorylase，GP，EC2.4.1.1）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。糖原的分解主要在GPa的催化下进行。
未添加激活剂时，GPa催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在nm下测定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
试验中所需的仪器和试剂:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
产品组成：
操作步骤(仅供参考)：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，g，4℃离心10min，取上清液待测。
二、测定步骤
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。2.工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。3.试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。4.试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。5.将工作液、试剂三和试剂四置于37℃预热5分钟；6.在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、50μL蒸馏水和μL工作液，立即混匀，记录nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。三、GPa酶活计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPa（nmol/min/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(W×V样÷V样总)÷T=×ΔA÷WV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。b.用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
（3）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPa（nmol/min/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(W×V样÷V样总)÷T=×ΔA÷WV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：96孔板光径，0.05cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。