NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
MDH（EC1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
溶液的配制：
1.试剂二：临用前加入μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2.试剂三：临用前加入μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每万细菌或细胞加入μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次），g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.05g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤：
1.紫外分光光度计/酶标仪提前预热30min，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2.试剂一37℃预热15min。
3.样本测定：
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96孔UV板中，充分吸打混匀后立即在nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA测定、ΔA空白。（空白管测1-2管即可）
三、NAD-MDH活力单位的计算
A：使用微量石英比色皿检测的计算公式如下
1．血清（浆）NAD-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)
2．组织中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mgprot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3．细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mgprot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应总体积，0.2mL；V样本：加入样本体积，0.mL；V提取：提取液体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；：细菌或细胞密度，万/mL；W：样本质量，g。
B：使用96孔UV板检测的计算公式如下
1.血清（浆）NAD-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)
2.组织中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mgprot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3.细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mgprot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(×V样本)÷T=21×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应总体积，0.2mL；V样本：加入样本体积，0.mL；V提取：提取液体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm；d：96孔UV板光径，0.6cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；：细菌或细胞密度，万/mL，W：样本质量，g。
注意事项：
1.粗酶液的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。
2.实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。
3.使用光径为1cm的微量石英比色皿时当初始读值小于0.7或者ΔA大于0.5时建议稀释后测量。使用96孔UV板时当初始读值小于0.4或者ΔA大于0.3时建议稀释后测量。
4.建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用96孔UV板同时测多个样本。