线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书
分光光度法25管/24样
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
测定意义：
复合体Ⅰ（EC1.6.5.3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
测定原理：
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+，在nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：0.5mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂五：1mL×1支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水；
工作液的配制：
临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；
用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、准确称取0.1g组织或收集万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆g，4℃离心5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，g，4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2）在1mL石英比色皿中加入40μL样本、μL工作液和60μL试剂六，立即混匀，记录nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算：
（1）按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/g鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(W×V样÷V样总)÷T=×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(×V样÷V样总)÷T=0.73×ΔA
V反总：反应体系总体积，9×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g；：细胞或细菌总数，万。
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