保健食物质料用菌种平安性
实验与评估本领引导准则（年版）
1界限
本引导准则规则了保健食物质料用细菌、丝状真菌（籽实体除外）和酵母的平安性评估中的致病性（毒力）实验与评估程序和法子。
本引导准则合用于保健食物质料用菌种（包罗保健食物配方用及质料临盆用菌种）的致病性实验与评估。
本引导准则不合用于基因改变微生物菌种和在我国无运用习惯的菌种致病性实验与评估。
2术语和界说
2.1致病性，Pathogenicity
微生物习染宿主形成强壮侵害引发疾病的才力。
2.2产毒才力，Toxigenicity
微生物形成对人和动物有毒效用的活性代谢产品的才力。
2.3毒性，Toxicity
微生物及其代谢产品对机体或许形成的潜在戕害（不良反响）。
3对拟评估微生物菌种需提交的根本质料请求
在施行致病性评估实验前，菌种送检单元需供应下列质料供评估单元查核。
3.1根本音信
拟评估菌种称号（包罗学名、俗名、曾用名、拉丁名等）、泉源及用处。
3.2菌种分类学质料
供应由有菌种判决天资的机构出具的对拟评估菌种的典范、科学的分类学（属、种称号及株）质料。细菌的分类和定名应遵命原核生物分类学国际委员会（InternationalCommitteeonSystematicsofProkaryotes）的规则，并契合原核生物国际定名规则（InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes）请求。真菌的分类和定名应按国际藻类、真菌和植物定名规则（InternationalCodeofNomenclatureforalgae,fungi,andplants）施行。
3.3菌种判决质料
依照今朝已有的学问，供应基于表型及基因测序本领判决到种水准的质料。做为保健食物的工效成份（活菌），还应供应判决到株水准的质料。
3.4菌种成长处境前提质料
供应拟评估菌种成长最适造就基及造就前提（造就光阴、造就温度和湿度、光照等），以及菌种收藏及复壮法子等干系质料。
3.5诱变菌种
过程诱变的菌种还需供应详细的菌种诱变法子（包罗运用的诱变剂、诱变前提及诱变实验过程等）和不少于代（传代隔绝不少于7天）的遗传不变性研讨汇报。
3.6临盆干系音信
包罗但不限于拟评估菌种平安用于保健食物的临盆纪录、工艺过程、企业准则等质料。
3.7国表里平安性评估质料综述
基于国表里文件数据，供应拟评估菌种的国表里运用史册和平安性评估质料，包罗其致病性和产毒才力的汇报、研讨文件或综述等；若无拟评估菌种的上述质料，应供应在亲缘关连上与其相近种属的平安性评估质料。
3.8其余国度容许质料
供应其余国度已容许拟评估菌种做为炊事增加剂、功用食物或通常食物临盆运用的干系解释质料。
3.9其余需求注明的音信。
4评估法子
对曾经供应以上质料的拟评估菌株，能够遵命下列法子开展评估。
4.1全基因组测序（WholeGenomeSequencing,WGS）
4.1.1基因测序
对拟评估菌株施行全基因组测序，别离赢得其基因组完竣图和框架图，测序汇报应包罗（但不限于）下列音信：
-DNA讨取法子
-测序计划及仪器征战
-序列组装法子
-序列原料评估
-FASTA文件
-与预期基因组巨细干系的堆叠群（Contigs）总长度
-基因诠释过程
-对真菌而言，还需供应从干系数据库中赢得的全基因组诠释原料音信。
4.1.2基因序列解析
将拟评估菌株的全基因组序列与已有的数据库，包罗但不限于毒力基因数据库（VFDB）、毒力/致病岛数据库（PAIDB）、生物警备数据库（MvirDB）等最新版本中保存的序列施行比对，并解析拟评估菌株遗传物资中与致病明了干系的已知毒力因子和毒素代谢干系基因的存在情状。应供应包罗（但不限于）下列音信的解析汇报：
-毒力/致病性（或产毒）干系基因称号、地点地方、与最新数据库中已有毒力基因的般配度等音信
-编码的卵白及序列号
-毒力/致病因子（毒素形成、侵蚀和粘附因子等）
-序列长度笼罩度≥60%
-输入序列与数据库中序列的般配度（≥85%）和e值（10-5）
-数据库中已有的菌株称号
-基因组图谱
-拟评估的真菌菌株还应依照文件报导能够形成的毒素典范，针对性检索能否存在毒素合成关键基因及其基因簇。
4.2动物致病性实验
由完备菌种致病性实验和评估天资的机构，别离遵命附录A、附录B和附录C规则的实验计划，对拟评估的保健食物用细菌、丝状真菌、酵母菌株开展致病性实验，对后果做出评估并出具汇报。
4.3产毒实验
对某些能够形成毒素的微生物，应在多种基质和前提下（单种类固体、多种类固体复合、不同成份的液体组合等）施行产毒实验，并遵命国度准则探测法子或国际机关/干系国度规则的准则探测法子施行有毒活性代谢产品含量探测。
5后果断定
5.1餍足下列通盘前提者，可用于保健食物。
5.1.1动物实验显示无致病性。
5.1.2产毒实验后果显示，在受试的任何一种基质中均不形成有毒活性代谢产品。
5.1.3依照现有学问，全基因组序列解析未发掘存在已知的毒力/致病基因（或毒素合成关键基因及其基因簇）。
5.2全基因组序列中发掘含有已知毒力/致病基因（或毒素合成关键基因及其基因簇），但动物实验显示不具备致病性、或产毒实验探测到已知的有毒活性代谢产品但其水准较低，长远摄取对人体强壮无影响，聚集国表里运用史册，可用于保健食物。
5.3动物实验显示具备致病性，或形成高水准已知有毒代谢产品，长远摄取或许影响人体强壮，不能用于保健食物。
附录A
(典范性附录)
保健食物质料用细菌致病性实验法子
1界限
本方规则定了保健食物质料用细菌的致病性实验法子。
本法子合用于保健食物质料用细菌的致病性实验。
2征战和材料
除微生物实习室老例灭菌和造就征战外，其余征战与材料下列：
2.1恒温造就箱：36℃±1℃。
2.2离心术：离心力3′g。
2.3电子天平：感量0.1g和0.g。
2.4比浊仪。
2.5温湿度计。
2.6显微镜：10×～×。
2.7厌氧造就安装：厌氧罐、厌氧箱。
2.8无菌锥形瓶：容量mL、mL。
2.9无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。
2.10无菌试管：16mm×mm。
2.11无菌造就皿：直径90mm。
2.12无菌量筒：容量mL。
2.13微量移液器及配套枪头：量程为μL～0μL。
2.14打针器：量程为μL～0μL。
2.15小鼠灌胃针头。
3造就基和试剂
3.1无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5gNaCl溶于0mL蒸馏水中，分装后℃高压灭菌15min，备用。
3.2LB肉汤造就基：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，备用。
3.3LB琼脂平板：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，制备LB琼脂平板，备用。
3.4半胱氨酸盐酸盐储存液：称取mg半胱氨酸盐酸盐于50mL无菌离心管中，参加10mL蒸馏水，充足消融后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
3.5含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤造就基：商品化MRS肉汤造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，待造就基冷却至50℃左右时，参加按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储存液，使造就基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为μg/mL，备用。
3.6含有半胱氨酸盐酸盐MRS琼脂平板：商品化MRS琼脂造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，待造就基冷却至50℃左右时，参加按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储存液，使造就基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为μg/mL，用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板。
3.7含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板：商品化双歧杆菌琼脂造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，待造就基冷却至50℃左右时，参加3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储存液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为μg/mL，用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板。
4实习动物
采用SPF级昆明或ICR强壮成年小鼠，牝牡参半，体重界限为18.0g～22.0g。
5职掌环节
通盘拟评估的菌株肯定运用腹腔打针和经口灌胃两种路径赋予动物受试物，以评估不同受试物泄漏路径对动物的致病性。
5.1腹腔打针
5.1.1菌株活化
今朝我国已容许的可用于保健食物的细菌主借使双歧杆菌属和乳杆菌属，除这两个属之外的其余新报告菌种在下列描写中均运用“其余细菌”。
依照送检菌株的保管状况，将双歧杆菌和乳杆菌首先接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤、其余细菌接种LB肉汤或适于该菌成长的最适液体造就基中，并置恰当的造就前提下（包罗造就温度、湿度，厌氧、需氧、微需氧等）造就一按光阴（造就光阴是非视不同菌种而异）。
5.1.2菌悬液制备
将5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板或含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板（乳杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板，其余细菌接种LB琼脂平板或适应于该菌成长的最适造就基琼脂平板），在规则的恰当造就前提下（包罗造就温度、湿度，厌氧、需氧、微需氧等）造就一按光阴（造就光阴是非视不同菌种而异）后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充足混匀后，用适当无菌生理盐水调动菌悬液浓度并比浊，使终究菌悬液中的菌浓度到达5.0×CFU/mL，用于小鼠腹腔打针。
5.1.3打针
小鼠不少于40只，牝牡参半，随机分红4组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠无菌生理盐水比较组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水比较组、雌性小鼠菌悬液组。每只小鼠打针0.2mL，即受试物组每只小鼠打针菌量不少于1.0×CFU。
5.1.4观测
动物腹腔打针后天天观测1次，最少赓续观测21d。
观测并纪录小鼠皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情状、肢体运动、做为方法等有无反常。尤其重视观测能否呈现振颤、抽搐、泻肚、嗜睡、流涎和昏厥等表象。实验前称量并纪录通盘小鼠的体重，实验竣事后称量并纪录通盘存活小鼠的体重。关于实验期间灭亡的小鼠，尽或许详细纪录小鼠的灭亡光阴，同时称重并纪录。
5.2经口灌胃
5.2.1菌数预估
无菌汲取上述5.1.1的造就液，别离加至两个无菌离心管中，每管1mL，′g离心10min，弃去上清液后，用适当无菌生理盐水调动菌悬液浓度并比浊，使终究菌悬液中菌的浓度别离不低于2.5×CFU/mL和1.25×CFU/mL，并别离纪录每mL造就液离心后所得沉没物中细菌数调动至2.5×CFU/mL和1.25×CFU/mL时需参加的无菌生理盐水的体积（mL）。
5.2.2菌悬液制备
5.2.2.1造就上清液的制备
依照受试动物总额和每只动物的灌胃体积揣度所需求的受试菌株造就液用量。汲取5.1.1造就液，将造就液一分为二，′g各离心10min后，将上清液别离转至mL无菌量筒中，一份上清液用于菌悬液原液的制备，另一份上清液冷冻浓缩至原体积的五分之一，做为5倍浓缩上清液，备用。
5.2.2.2菌悬液原液的制备
遵命5.2.1中赢得的细菌终浓度到达2.5×CFU/mL所需求的生理盐水体积，依照离心的造就物体积，按不异比例参加5.2.2.1赢得的上清液，调动离心后的沉没物使其细菌数到达2.5×CFU/mL（上清液量不敷时可用空白造就基补齐）。
5.2.2.3浓缩菌悬液的制备
遵命5.2.1中赢得的细菌终浓度到达1.25×CFU/mL所需求的生理盐水体积，依照离心的造就物体积，按不异比例参加5.2.2.1赢得的5倍浓缩上清液，调动离心后的沉没物使其细菌数到达1.25×CFU/mL。
5.2.3灌胃
小鼠不少于80只，牝牡参半，别离随机分红8组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠造就基比较组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩造就基比较组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组；雌性小鼠造就基比较组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩造就基比较组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃，赓续灌胃3d，初次灌胃前小鼠应禁食住宿（16h），灌胃后3h～4h喂食。
5.2.4观测
动物经口灌胃后天天观测1次，最少赓续观测21d，观测目标同5.1.4。
6后果与汇报
对5.1和5.2的动物实验后果施行统计学解析和归纳评估，包罗：
（1）受试物对动物寻常强壮情状有无不良影响。
（2）受试物对动物体重等指目标影响。
（3）受试物组动物灭亡情状。
（4）若受试物组动物在实验期间未呈现中毒病症或灭亡，且体重等目标与比较组比拟差别无统计学意义，便可断定该菌株无致病性；若受试物组动物在实验期间呈现中毒病症或灭亡，或实验期间体重等目标与比较组比拟有显著性差别，便可断定该菌株具备致病性。
附录B
(典范性附录)
保健食物质料用丝状真菌的致病性实验法子
1界限
本方规则定了保健食物质料用丝状真菌的致病性实验法子。
本法子合用于保健食物质料用丝状真菌的致病性实验。
2征战和材料
除微生物实习室老例灭菌及造就征战外，其余征战和材料下列：
2.1恒温造就箱：28℃±1℃。
2.2电子天平：感量为0.1g。
2.3锥形瓶：容量为mL。
2.4无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。
2.5显微镜：10×～×。
2.6微量移液器及配套枪头：量程为μL～0μL。
2.7血球计数板。
2.8打针器：量程为μL～0μL。
2.9小鼠灌胃针头。
2.10温湿度计。
2.11接种钩。
2.12球磨仪或功用相当的仪器。
2.13无菌造就皿：直径90mm。
3造就基和试剂
3.1麦芽汁琼脂平板：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，制备麦芽汁琼脂平板，备用。
3.2土豆葡萄糖琼脂平板：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，制备土豆葡萄糖琼脂平板，备用。
3.3无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5gNaCl溶于0mL蒸馏水中，分装后℃高压灭菌15min，备用。
如拟评估菌株在上述两种造就基上的成长状况和产胞子量均不睬想，可采用适于该菌株成长和产孢的其余造就基。
4实习动物
采用SPF级昆明或ICR强壮小鼠，牝牡参半，体重界限为18.0g～22.0g。
5职掌环节
通盘拟评估菌株肯定运用腹腔打针和经口灌胃两种路径赋予动物受试物，以评估不同受试物泄漏路径对动物的致病性。
5.1腹腔打针
5.1.1菌悬液制备
5.1.1.1产胞子量大的菌株：将拟评估菌株接种于土豆葡萄糖琼脂平板（红曲霉属菌株接种麦芽汁琼脂平板）或适于拟评估菌株成长的造就基平板，28℃±1℃造就7d～14d后，挑取平板上的胞子，将其悬浮于无菌生理盐水中，充足混匀后，用血球计数板计数胞子浓度，并用适当无菌生理盐水调动，使其终究浓度不低于5.0×CFU/mL。
5.1.1.2产胞子量少或不产胞子的菌株：将拟评估菌株接种于恰当的造就基上，28℃±1℃下造就7d～14d或在恰当的向导产孢前提下造就一按光阴后，挑取平板的菌丝体及胞子，用球磨仪（或其余功用相当的仪器）将菌丝体磨碎，经生理盐水重悬后，用血球计数板计数，并用适当无菌生理盐水调动，使菌悬液中菌丝体片断数/胞子的终究浓度不低于5.0×CFU/mL。
5.1.2打针
小鼠不少于40只，牝牡参半，别离随机分红4组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠生理盐水比较组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水比较组、雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠打针0.2mL，即受试物组每只小鼠打针的菌量不少于1.0×CFU。
5.1.3观测
动物腹腔打针后天天观测1次，最少赓续观测21d，观测目标同附录A中的5.1.4。
5.2经口灌胃
5.2.1菌悬液制备
除制备的菌悬液中真菌胞子/菌丝体片断的浓度不低于2.5×CFU/mL外，其余职掌环节同5.1.1。
5.2.2灌胃
小鼠不少于40只，牝牡参半，别离随机分红4组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠生理盐水比较组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水比较组、雌性小鼠菌悬液组，各组均以20mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃1次，灌胃前禁食住宿（16h），灌胃后3h～4h喂食。
5.2.3观测
动物经口灌胃后天天观测1次，最少赓续观测21d，观测目标同附录A中的5.1.4。
6后果与汇报
对5.1和5.2的动物实验后果施行统计学解析和归纳评估，实质同附录A中的条目6。
附录C
(典范性附录)
保健食物质料用酵母的致病性实验法子
1界限
本方规则定了保健食物质料用酵母的致病性实验法子。
本法子合用于保健食物质料用酵母的致病性实验。
2征战和材料
除微生物实习室老例灭菌及造就征战外，其余征战和材料下列：
2.1恒温造就箱：28℃±1℃。
2.2电子天平：感量为0.1g。
2.3锥形瓶：容量为mL。
2.4无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。
2.5显微镜：10×～×。
2.6微量移液器及配套枪头：量程为μL～0μL。
2.7血球计数板。
2.8打针器：量程为μL～0μL。
2.9小鼠灌胃针头。
2.10温湿度计。
2.11接种环。
2.12离心术：离心力3′g。
2.13无菌造就皿：直径90mm。
2.14无菌量筒：容量mL。
3造就基和试剂
3.1麦芽汁琼脂平板：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，制备麦芽汁琼脂平板，备用。
3.2麦芽汁造就基：商品化造就基遵命产品注明书用蒸馏水配制，充足加热消融后分装，℃高压灭菌15min，制备麦芽汁造就基，备用。
3.3无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5gNaCl溶于0mL蒸馏水中，分装后℃高压灭菌15min，备用。
如拟评估菌株在麦芽汁造就基上的成长状况不睬想，可采用适于该菌株成长的其余造就基。
4实习动物
采用SPF级昆明或ICR强壮小鼠，牝牡参半，体重界限为18.0g～22.0g。
5职掌环节
通盘拟评估菌株肯定运用腹腔打针和经口灌胃两种路径赋予动物受试物，以评估不同受试物泄漏路径对动物的致病性。
5.1腹腔打针
5.1.1菌悬液制备
将拟评估菌株接种麦芽汁琼脂平板，28℃±1℃造就一按光阴（造就光阴是非视不同菌种而异）后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充足混匀后用血球计数板计数，并用适当无菌生理盐水调动菌悬液浓度，使菌悬液中菌的终究浓度不低于5.0×CFU/mL。
5.1.2打针
小鼠不少于40只，牝牡参半，别离随机分红4组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠生理盐水比较组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水比较组及雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠打针0.2mL，即受试物组每只小鼠打针的菌量不少于1.0×CFU。
5.1.3观测
动物腹腔打针后天天观测1次，最少赓续观测21d，观测目标同附录A中的5.1.4。
5.2经口灌胃
5.2.1菌株造就
将菌株接种到麦芽汁造就基上，28℃±1℃造就一按光阴（造就光阴是非视不同菌种而异）后，备用。
5.2.2菌数预估
无菌汲取上述5.2.1的造就液，别离加至两个无菌离心管中，每管1mL，′g离心10min，弃去上清液后，用适当无菌生理盐水调动菌悬液浓度并计数，使终究菌悬液中菌的浓度别离不低于2.5×CFU/mL和6.25×CFU/mL，并别离纪录每mL造就液离心后所得沉没物中酵母菌数调动至2.5×CFU/mL和6.25×CFU/mL时参加无菌生理盐水的体积（mL）。
5.2.3菌悬液制备
5.2.3.1造就上清液的制备
依照受试动物总额和每只动物的灌胃体积揣度所需求的受试菌株造就液用量，既而将造就液一分为二，′g各离心10min后，将上清液别离转至mL无菌量筒中，一份上清液做为菌悬液原液的制备，另一份上清液冷冻浓缩至原体积的五分之二，做为2.5倍浓缩上清液，备用。
5.2.3.2菌悬液原液的制备
遵命5.2.2中赢得的酵母终浓度到达2.5×CFU/mL所需求的生理盐水体积，依照离心的造就物体积，按不异比例参加5.2.3.1赢得的上清液，调动离心后的沉没物使其酵母数到达2.5×CFU/mL（上清液量不敷时可用空白造就基补齐）。
5.2.3.3浓缩菌悬液的制备
遵命5.2.2中赢得的酵母菌终浓度到达6.25×CFU/mL所需求的生理盐水体积，依照离心的造就物体积，按不异比例参加5.2.3.1赢得的造就上清液2.5倍浓缩液，调动离心后的沉没物使其菌数到达6.25×CFU/mL。
5.2.4灌胃
小鼠不少于80只，牝牡参半，别离随机分红8组（每组不少于10只），包罗雄性小鼠造就基比较组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠2.5倍浓缩造就基比较组、雄性小鼠2.5倍菌悬液组；雌性小鼠造就基比较组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠2.5倍浓缩造就基比较组及雌性小鼠2.5倍菌悬液组。各组均以20mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃1次，灌胃前应禁食住宿（16h），灌胃后3h～4h喂食。
5.2.5观测
动物经口灌胃后天天观测1次，最少赓续观测21d，观测目标同附录A中的5.1.4。
6后果与汇报
对5.1和5.2的动物实验后果施行统计学解析和归纳评估，实质同附录A中的条目6。
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