天然培养基，合成培养基，半合成培养基是食用菌培养基的主要的存在形式。经常使用合成培养基。
一级种培养基多用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。它的配方为：土豆克、葡萄糖18~20克、琼脂18~22克，毫升自然水，蒸馏水为最好。
操作方法：第一个步骤第，土豆去皮克，切成小块放入锅中，加毫升，加热至沸腾，维持20~30分钟(能用玻璃棒戳破即可。用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补水分至毫升。第二个步骤，加热溶解。滤液锅中加热，再据需要加入18~22克琼脂加热搅拌混匀，琼脂溶解后加入葡萄糖搅拌均匀，冷却后再补足水分至毫升。
第三个步骤，将配制的培养基装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗，以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染，三角漏斗可以用硬纸折叠而成，装量固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度1/3。
第四个步骤：培养基分装结束，塞上棉塞或泡沫塑料塞或试管帽。不要小看这小小的棉塞，他的作用可真不小，它可以保持通气，还可以缓解水分的蒸发。塞时棉塞长度的1/3留在试管口外，2/3进管。第五个步骤包牛皮纸，橡皮筋捆好，在牛皮纸上，写好日期，名称、组别。
第六个步骤灭菌。℃灭菌20-30分钟。第七个步骤，试管斜放桌上，做成斜面培养基。锥形瓶取出后摇匀凝结备用。
灭菌效果如何？可以采取少量试管放置于25℃恒温箱中培养3~5天观察，培养基表面没有杂菌以及乳白色细菌产生则灭菌彻底，可扩接母种用。反则丢弃。
二级种三级种培养基的制备。原种、栽培种培养基可用相同配方及配制步骤。用阔叶树木屑、米糠、石灰等按比例配制后装袋消毒。装好的料袋要当天灭菌、以免料变质，温度维持在℃、持线时间8∽10小时，之后冷却使其温度降到适合食用菌接种为宜。冷却环境时要洁净，注意降温不要过猛防止二次污染。
接种的方法：按无菌操作技术要求将目的微生物移接到培养基质中的过程。将母种培养基放人接种箱并密封，用甲醛熏蒸或二氯异氰尿酸盐烟雾剂，也可用紫外线灯照射。
食用菌母种接种时需注意的细节：一是酒精灯火焰要高，二是母种试管表面和管口要灭菌彻底，最实用的方法是用酒精灯火焰在上转动2~3圈。三是拔塞、取种、接种及棉塞必须在火焰上方或附近，试管一旦打开棉塞，就不能离开火焰是。四是接种钩要灼烧彻底，火焰上方反复灼烧3~4次烧红。五是接种时掉到地上的棉塞不能使用，六悬接种钩火焰灭菌后要冷却，防烫死菌种。七是消毒酒精要清洁。八是操作要到位，动作轻盈敏捷、快速准确，尽可能地减小声音。九是接种后及时清理，开窗排废气，之后关门窗，打开紫外线灯进行使用后的消毒，便于以后使用。
食用菌母种生产中常见的问题：培养基凝固不良；有时灭菌后培养基凝固不良，培养基酸化；接种物不萌发；菌种品种退化老化；细菌污染；真菌污染，试管接种时还带有霉菌孢子，接种物表面的菌丝有霉菌污染，冷却时冷凝水曾浸湿棉塞或分装时管口沾有培养基，培养环境大气相对湿度过高，通风不良等问题。