乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定nm吸光度下降速率，来计算ADH活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
试验中所需的仪器和试剂:
冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。
产品组成：
溶液的配制：
1.提取液：内含不溶物，使用前摇匀；
2.试剂一：临用前把试剂二转移到试剂一中，分装保存于-20℃。
自备材料：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤(仅供参考)：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。
2.细菌、细胞：按照细胞数量（个）：提取液体积（mL）为~0：1的比例（建议万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
二、测定步骤
1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到nm，蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃水浴中保温30min以上。
3.空白管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸馏水、μL试剂一和20μL试剂三，迅速混匀后于nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。（空白管只需做1~2个）
4.测定管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL上清液、μL试剂一和20μL试剂三，迅速混匀后于nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。
三、ADH活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/mgprot)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(Cpr×V样)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/g质量)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/cell)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/mL)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷V样÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：单位换算系数，1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；细胞数量：以万计。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/mgprot)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(Cpr×V样)÷T
=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/g质量)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(W×V样÷V样总)÷T
=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/cell)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。
ADH(U/mL)=[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×]÷V样÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：单位换算系数，1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；细胞数量：以万计。
注意事项：上清液蛋白质浓度需要另外测定。