抗坏血酸氧化酶（AAO）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容：
溶液的配制：
1.试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样品处理
称取约0.1g样本，加提取液1mL，冰上充分研磨，10g4℃离心20min，取上清液待测。
二、测定操作
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到nm，蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃水浴锅中预热30min。
3.按下表依次在微量石英比色皿/96孔板中加入试剂。
迅速混匀后在nm测定10s和s的吸光值，分别为A1、A2，用A1减A2，得到ΔA空白管、ΔA测定管。
三、AAO活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolAsA为1个酶活单位。
AAO(U/mgprot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×÷(Cpr×V样)÷T
=0.×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmolAsA为1个酶活单位。
AAO(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
ε：AsA在nm处消光系数，5.42×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：单位换算系数，1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolAsA为1个酶活单位。
AAO(U/mgprot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×÷(Cpr×V样)÷T
=0.×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmolAsA为1个酶活单位。
AAO(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
ε：AsA在nm处消光系数，5.42×L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：单位换算系数，1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
注意事项：
由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。