α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1.4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和葡萄糖,使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失,以该颜色消失的速度计算酶的活力。β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末段分解2个葡萄糖单位的α-1.4糖苷键生成麦芽糖。因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。
1.仪器设备
分光光度计、恒温水浴等。
2.操作方法
1)粗酶液制备
取新鲜植物材料10g,洗净、剪碎,按1:2(w/v)比例加20ml0.1mol/LNaAc缓冲液(含6mmol/LCaCl2,pH5.0)及少量石英砂研磨,一层尼龙布过滤。滤液在r/min离心20min,取上清液用10mmol/LNaAc缓冲液透析。过夜后用r/min离心10min,取上清液定容,备用。
2)绘制β-极限糊精标准曲线
称取mgβ-极限糊精,加少量水调成糊状,倾入10ml沸蒸馏水,不断的搅拌、加热,煮至透明。流水冷却后定容至10ml,即每毫升含10mgβ-极限糊精。取25~μlβ-极限糊精(0.25~2.0mg)加水定容至0.5ml,再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于nm处测定其光密度(OD)值。以光密度为纵坐标,β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。
3.α-淀粉酶活力测定
取0.1~0.5ml粗酶液(相当于含0.1~0.2g鲜重),加0.5mlβ-极限糊精,加10mmol/LNaAc缓冲液定容至1.0ml,摇匀后在30℃保温。隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-KI试剂,0.4mlH2O,摇匀后在nm处测其光密度。按OD值查标准曲线。计算单位为:mgβ-极限糊精降解/g(鲜重)·h。
4.β-淀粉酶活力的测定
1)酶反应
在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉,1ml0.1mol/LNaAc(pH5.0)缓冲液,3.9mlH2O,在37℃预热5min,加0.1ml酶液,保温30min后煮沸10min。冷却后用DNS法测定还原糖。以每小时生成1mg麦芽糖所需的酶量作为一个酶活力单位。
酶活力(mg/ml)=1.9K×OD×10×2×n/0.5×0.1
n:酶液稀释倍数;K:每一OD值所相当的葡萄糖量(mg);1.9:葡萄糖换算成麦芽糖的换算因子。
2)DNS法定糖
取试管加1.5mlDNS试剂,0.5ml样品,沸水浴中加热15min,冷却后加10.5mlH2O,摇匀后用分光光度计在nm处测定其光密度。同时,用不同浓度的葡萄糖制作标准曲线,求K值。
(注:DNS试剂:称10g3,5-二硝基水杨酸,溶解于水中,加入20g氢氧化钠,g酒石酸钾钠,加水ml,加热溶解后加重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌,冷却后定容至0ml贮存于棕色瓶中,放置一星期后使用)。