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食品微生物学检验菌落总数测定
1范围本标准规定了食品中菌落总数(Aerobicplatecount)的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2术语和定义菌落总数aerobicplatecount食品检样经过处理，在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。检验菌种类：需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌。不含厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌。也不包括真菌，真菌有单独的检验方法。菌落总测定是用于判定食品被细菌污染的程度和卫生质量，反应食品在生产过程中是否符合卫生要求。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。主要为细菌的培养提供恒定的温度3.2冰箱：2℃~5℃。
用于试剂及菌株的保存3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。用于对已灭菌但未用的固体培养基的保温;
温度可以在46℃～50℃之间，只要用时温度合适就行
3.4天平：感量为0.1g。称取培养基及样品称取，需单独两个天平，一个放准备室，一个放检测室3.5均质器。对待检试样液的均质，使试样液的菌含量保持一致，包括匀浆机和拍打式均质器，匀浆机涉及到固体非粉末状样品，拍打式均质器适用于除固体非粉末状样品外的样品3.6振荡器。与均质器作用一致3.7无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。用于试液转移，微量移液器需定时检定和灭菌，一次性吸头需湿热灭菌处理后烘干水分再使用3.8无菌锥形瓶：容量mL、mL。盛装培养基及试样液，试样液可用均质袋替代3.9无菌培养皿：直径90mm。
玻璃培养皿灭菌需放入金属灭菌桶后选用恒温干燥箱℃灭菌3小时及以上，一次性塑料无菌培养皿拆包装前需紫外杀菌15min以上3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。仅用于自配培养基的pH调节，商用培养基基本上不需要调节pH值3.11放大镜或/和菌落计数器。用于培养后的培养基进行菌落计数4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基：见A.1。主要培养基，成分适合细菌进行繁殖4.2磷酸盐缓冲液：见A.2。成分较无菌生理盐水更科学合理，磷酸盐可在适宜范围内调节试样液本身pH，降低因样品本身的pH对实验造成影响，适用于酸类、碱类和高盐类样品的菌落计数。用前需湿热灭菌℃持续15min（推荐用）4.3无菌生理盐水：见A.3。较磷酸盐缓冲液优势为更易配制。用前需湿热灭菌℃持续15min5检验程序菌落总数的检验程序见图1。图1菌落总数的检验程序6操作步骤除样品外所有操作需要使用的试剂耗材，必须灭菌，设备设施可采用紫外杀菌及75%浓度酒精擦拭后使用6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，r/min~r/min均质1min~2min，或放入盛有mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1∶10的样品匀液。25g样品：精确到0.1g，偏差25+0.2g，尽量不要偏差太大，可多不可少。
在标准无规定的情况下，最好按25g称样进行实验，这符合GB.1中对抽样遵循代表性原则。当称样数量越少，代表性越差。
mL稀释液：可使用灭菌后的量筒量取，也可以配制分装好后灭菌直接用（比灭菌后量取劣势为水分灭菌易挥发，导致稀释液浓度改变）。用哪种可自由选择，但特殊样品（酸类、碱类、高盐类）尽量使用磷酸盐缓冲液，避免样品本身PH造成实验误差。
均质器拍打：固体样品可选用均质器均质，使样液混匀；速溶类样品可不用均质器。1:10样品匀液：1mL样液→9mL试管稀释液=10mL匀液，样液加入后可使用无菌吸管吹打（尽量不用，减少污染），也可摇匀，尽量使液体保持在试管口以下。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。无菌玻璃珠：用于混匀样液与缓冲液6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶的样品匀液。沿管壁缓慢注：可能在管壁残留细菌，需要震摇试管，将管壁上的试液混合于匀液中。若使用无菌吸头，可直接垂直于试管将试液打入稀释液中，不靠试管壁，吸头不入液面。
在样品菌落数范围未知/无法通过以往样品判断菌落数范围时，应多做几个稀释度。
6.1.4按6.1.3操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。尽量避免稀释梯度之间的污染6.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。根据以往的样品大概的菌含量预估样品的菌含量，适当选择2个~3个稀释梯度，可以选择2个稀释梯度，但必须有1个至2个梯度的菌含量在范围内
例：-1（皿1皿2）-2（皿1皿2）空白（皿1皿2）
6.1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。平板计数琼脂培养基温度需适宜，以不烫手为宜（水浴箱中拿出的培养基温度适中，可直接使用，无需冷却）。
有些样品为避免白色食物残渣在计数时的影响，会在PCA中加入TTC（各大培养基厂商有售无菌TTC溶液），使培养后的菌落呈红色。此项适用于食物残渣中含白色物质。
转动平皿使其混合均匀：平皿保持同方向，手拿平皿边缘按前后运动、左右运动、顺时针混匀，禁止培养基因大力转动造成溢出，培养基冷凝后方可倒置平皿培养。
本标准未规定称取至倒培养基的过程时间，一旦样品过多，尽量保持在45min之内。（新标准意见稿中也没写，.3中写大肠菌群操作时间是15min，为的是避免过程中因时间过长导致细菌繁殖）
6.2培养6.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。倒置平皿培养，温度36℃±1℃，记录温度时需准确，不出现±符号。一般培养箱检定时会提供一个偏差值，需要在原有温度基础上修正偏差量
水产品培养温度比正常的样品要低，主要原因是水产品长期处于水中，生长环境温度较低。6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。6.3菌落计数6.3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。CFU指单个培养皿的菌落个数。6.3.2选取菌落数在30CFU~CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。6.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7结果与报告
7.1菌落总数的计算方法7.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算：7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均＜30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均＞CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~CFU之间,其中一部分＜30CFU或＞CFU时,则以最接近30CFU或CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2菌落总数的报告7.2.1菌落数小于CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。菌落数指计算后的结果，即公式（1）中的N
例如计算结果为35CFU/(g)mL，则报35CFU/(g)mL，不需要再修约。
7.2.2菌落数大于或等于CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。例如计算结果为，则报3CFU/(g)mL或3.5×CFU/(g)mL7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。菌落蔓延时根本无法计数，只能报菌落蔓延，然后重测。再测时可在凝固的培养基表面倾注薄层培养基。7.2.4若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。空白对照长菌，证明环境/试剂/工具有污染。
此条可理解为当空白对照没长菌落时，可以用“未检出”表示
7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。附录A培养基和试剂A.1平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基A.1.1成分A.1.2制法
将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0±0.2。分装试管或锥形瓶,℃高压灭菌15min。有商品化脱水培养基，不用自行调节pH，可直接使用，有效避免自配产生的误差。
其中样品为白色或偏白色时，培养基中可添加1%的无菌TTC进行菌落着色，着色后菌落为红色。
煮沸溶解：适用于自配培养基，商品化脱水培养基可不进行此操作（灭菌前需分装的培养基除外）
A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于mL蒸馏水中,用大约mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用蒸馏水稀释至0mL后贮存于冰箱。A.2.2制法稀释液：取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至0mL，分装于适宜容器中，℃高压灭菌15min。有商品化脱水培养基，直接使用，有效避免自配产生的误差。A.3无菌生理盐水A.3.1成分A.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于0mL蒸馏水中，℃高压灭菌15min。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇