WesternBlot既冗长又繁琐，而且很多人获得的结果都是空白膜或不清晰。出现这些问题到底是受到了什么影响呢?导致上述问题的因素有很多，如下：
1、胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。
2、转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。
避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，使用预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。
试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20℃。
3、抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1：-1:0来稀释血清或组织培养上清，以1：0-1：00来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：。
4、酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的Westernblot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，只能使用蒸馏的去离子水。
5、使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。
6、检测系统缺乏足够的灵敏度：确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：
辣根过氧化物酶pg/band
碱性磷酸酶pg/band
增强的碱性磷酸酶5pg/band
胶体金pg/band
增强的胶体金10pg/bandImmun-Star
化学发光10pg/band
Cell-basedELISA介绍
Cell-basedELISA也称为Cell-ELISA或In-CellELISA,是一种基于细胞的ELISA检测方法，可原位检测细胞蛋白的相对水平。该技术起源于年英国伯明翰大学的实验室，而后经过发展以及改进，越来越受到科研用户的青睐，目前使用该技术进行检测的文献已有0多篇。
对激酶的假说验证和药物筛选实验，常用的检测方法有westernblot、ELISA等，但是它们无法模拟细胞内的环境。而Cell-basedELISA则能在真实的细胞状态下测定蛋白磷酸化，从而更加准确地代表特定信号通路的状态，因此能在蛋白磷酸化检测中获得更好的效果。
Cell-basedELISA原理
将细胞种到96孔板上，然后对细胞进行固定透化（方便抗体进入细胞内），接着加入一抗二抗孵育、显色，最后测量信号。
目前检测体系分为：
1、比色法测定（酶标仪）检测；
2、荧光显色测定（荧光读板机/荧光酶标仪）。
检测原理分别如下图所示：
图1.比色法测定
图2.荧光显色测定
优势
年
1、简便省时省事，无需制备细胞裂解液。可部分替代westernblot；
2、可高通量分析检测，灵敏度相比westernblot要高；
3、对于磷酸化蛋白研究，可同时检测磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白水平，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，结果更可靠。
接下来我们分享一个Cell-basedELISA应用的案例，该篇文章于年发表在MolecularCancer（IF=16.）杂志上[1]。Cell-basedELISA检测LNCaP和PC3细胞中ERK1/2的活性和总水平。
分别用不同的药物对两个细胞进行处理，然后通过Cell-basedELISA分别读出p-ERK1/2和总ERK1/2的表达水平。再对细胞进行结晶紫染色，读出吸光度，确定每孔中细胞的相对数量，最后将p-ERK1/2与总ERK1/2的比值与每孔细胞密度归一化，得出上图结果。
以下神器助你解决这个难题：
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效率大大提高
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