顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
顺乌头酸酶(aconitase)，三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。
ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将NAD+还原生成NADH，导致nm处光吸收上升。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
试剂一：mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加1.5mL蒸馏水充分溶解；现配现用
试剂七：粉剂×1支，4℃保存；临用前加12mL试剂四充分溶解；
工作液：临用前在12mL试剂七中加入1mL蒸馏水、1mL试剂四、1mL试剂五、1mL试剂六充分混匀。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
1.组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
2.称取约0.1g组织或收集万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
3.将匀浆转入离心管内g，4℃离心5min。
4.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，10g，4℃离心10min。
5.上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
6.在步骤④的沉淀中加入μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率20%或W，超声3秒，间隔10秒，重复30次)，用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
测定步骤：
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2.样本测定
(1)将工作液，置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20℃保存，一星期内可用。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL样本μL工作液，混匀，立即记录nm处20s时的吸光值A1和3min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
ACO活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性(nmol/min/mgprot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(Cpr×V样)÷T=×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(W×V样÷V样总)÷T=54×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性(nmol/min/cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(×V样÷V样总)÷T=0.×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；：细菌或细胞总数，万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性(nmol/min/mgprot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(V样×Cpr)÷T=×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(W×V样÷V样总)÷T=×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性(nmol/min/cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(×V样÷V样总)÷T=0.×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；：细菌或细胞总数，万。