卵白定量测定法子汇总
1.Lowry法探测卵白质的含量
2.凯氏定氮法测定卵白浓度
3.BCA法测定卵白浓度
4.考马斯亮蓝法测定卵白浓度
5.双缩脲法测定卵白浓度
6.Anm紫外光摄取法测定卵白浓度
Lowry法探测卵白质的含量实行道理
首先在碱性前提下卵白质与铜影响生成卵白质-铜复合物，该复合物参预folin-酚试剂后孕育蓝色复合物。该蓝色复合物在nm处的吸光度值与卵白质的含量成正比，按照供试品的吸光度，计划供试品的卵白质含量。
凯氏定氮法测定卵白浓度一、实行道理
卵白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂协同加热消化，使卵白质分解，孕育的氨与硫酸连系生成硫酸铵，留在消化液中，而后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸摄取后，再用盐酸准则溶液滴定，按照酸的损耗量来乘以卵白质换算系数，即得卵白质含量。
二、仪器与试剂
硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为1.g/L）硼酸溶液（20g/L）
氢氧化钠溶液（g/L）0.01mol/L盐酸准则滴定溶液。
搀杂批示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临历时搀杂。
微量定氮蒸馏安设：如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮安设
1、电炉；2、水蒸气产生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；
4、小漏斗及棒状玻璃塞（样本入口处）；5、反映室；6、反映室外层；
7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液领受瓶。
三、实行环节
1、样本消化
称取样本约2.00g（±0.g），移入枯燥的mL凯氏烧瓶中，参预0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，参预20mL浓硫酸，将瓶以角斜支于有小孔的石棉网上，行使万用电炉，在透风橱中加热消化，最先时用低温加热，待体例物集体炭化，泡沫中止后，再抬高温度维持微沸，消化至液体呈蓝绿色廓清通明后，继承加热0.5h，取下放冷，严慎加20mL水，放冷后，无损地转变到mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实行：取与样本消化类似的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上一样法子实行消化，冷却，加水定容至mL，得试剂空白消化液。
2、定氮安设的反省与洗濯
反省微量定氮安设能否装好。在蒸气产生瓶内装水约三分之二，加甲基红批示剂数滴及数ml硫酸，以维持水呈酸性，参预数粒玻璃珠（或沸石）以防范暴沸。
测定前定氮安设下列法洗濯2~3次：从样本入口入加水适当（约占反映管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，孕育的蒸汽冲刷冷凝管，数分钟后封闭夹子a，使反映管中的废液倒吸流到反映室外层，翻开夹子b由橡皮管排出，如许数次，便可行使。
3、碱化蒸馏
量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，参预搀杂批示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a封闭，螺旋夹b开启的形态下，的确汲取10.0mL样本消化液，由小漏斗流入反映室，并以10mL蒸馏水洗濯进样口流入反映室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其慢慢流入反映室，用少许水冲刷立刻将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，封闭螺旋夹b，最先蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，挪移领受瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。而后用少许水冲刷冷凝管下端外部，取下三角瓶，筹办滴定。
同时汲取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏职掌。
4、样本滴定
以0.01mol/L盐酸准则溶液滴定至灰色为止境。
5、数据纪录
项目
第一次
第二次
第三次
样本消化液（mL）
滴定损耗盐酸准则溶液（mL）
损耗盐酸准则溶液平衡值（mL）
四、完毕计划
式中X——样本卵白质含量（g/g）；
V1——样本滴定损耗盐酸准则溶液体积（mL）；
V2——空白滴定损耗盐酸准则溶液体积（mL）；
c——盐酸准则滴定溶液浓度（mol/L）；
0.——1.0mL盐酸准则滴定溶液相当的氮的原料（g）；
m——样本的原料（g）；
F——氮换算为卵白质的系数，通常食品为6.25；乳成品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其成品为5.71；肉与肉成品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、往日葵5.30。计划完毕保存三位灵验数字。
五、注重事故及申明
1、本法也合用于半固体试样以及液体样本探测。半固体试样通常取样领域为2.00g~5.00g；液体样本取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。若探测液体样本，完毕以g/mL示意。
2、消化时，若样本含糖高或含脂及较多时，注重节制加热温度，免得大批泡沫喷出凯氏烧瓶，孕育样本损失。可参预少许辛醇或液体白腊，或硅消泡剂削减泡沫孕育。
3、消化时应注重回旋凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样本齐全消化。若样本不易消化至廓清通明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，参预数滴过氧化氢后，再继承加热消化至齐全。
4、硼酸摄取液的温度不该超越40℃，不然氨摄取松开，孕育探测完毕偏低。可把领受瓶置于冷水浴中。
5、在反复性前提下取得两次自力测定完毕的绝对差值不得超越算术平衡值的10%
BCA法测定卵白浓度一、实行道理
BCA(bicinchoninicacid)是一种波动的水溶性复合物，在碱性前提下，二价铜离子也许被卵白质复原成一价铜离子，一价铜离子也许和BCA互相影响，两分子的BCA螯合一个铜离子，孕育紫色的络合物，该复合物为水溶性，在nm处显示强吸光性，在肯定浓度领域内，吸光度与卵白质含量呈精良的线性瓜葛，制做准则弧线，因而也许按照待测卵白在nm处的吸光度计划待测卵白浓度。
二、实行筹办
1.BCA定量试剂盒（可置备）：含A液和B液
A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠，2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体搀杂后再调PH至11.25）
B液：4%硫酸铜
2.牛卵白血清（BSA）
3.待测的卵白样本
三、实行环节
1.设置BCA做事液：将A液和B液摇摆混匀，遵照A:B=50:1的比例设置BCA做事液，充足混匀。（BCA做事液室温下24h内波动，故现用现配）
2.设置不同浓度的准则卵白液（BSA），1μg/μl，2.5μg/μl，5μg/μl，7.5μg/μl，10μg/μl，待测卵白样本在甚么溶液中，就用该溶液来稀释准则卵白液（如待测样本溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释准则卵白液）。
3.取空白组（0μg/μlBSA）和各浓度的准则卵白液5ul参预96孔板中，另取待测的卵白样本5ul，参预96孔板。
4.向各孔的卵白液中参预ul的BCA做事液，混匀，37度安置30分钟，（加样时应该行为温柔，防范孕育气泡影响读数）。PS：温度和安置功夫也许调换，可在60度安置30分钟or室温安置2小时。
5.静置完成后，冷却至室温，用酶标仪测定nm波益处的吸光度，并制做准则弧线。
6.按照待测样本的吸光度，比对准则弧线，计划卵白的浓度。
注重事故
BCA法测定卵白浓度时，吸光度可随功夫的拉长一直加深，且显色反映会随温度抬高而放慢，故假设浓度较低，妥帖较高温度孵育or拉长孵育功夫。
准则卵白液的加量应该的确，假设加量不许确，会致使制做出来的准则弧线浮现误差，影响待测样本的浓度计划，因而一方面需求用梯度稀释的法子来设置准则卵白液，另一方面应行使详细度高的移液枪。
A液和B液搀杂也许浮现混浊，此时应成份震撼混匀，结尾看来通明溶液。
为放慢BCA法测定卵白浓度的速率也许合合用微波炉加热，但切勿过热。
当完毕浮现空白组自身就有较高的配景，可用Bradford法从新测定卵白浓度。
优毛病
益处：
测定倏地轻便，45分钟内实现
的确精巧,探测浓度为5-mg/ml
骚扰物资少，BCA法不受大部份样本中的去垢剂等化学物资影响，可兼容样本中高达5%的SDS，5%TritonX-,5%的Tween20
在肯定浓度领域内，有精良的线性瓜葛
探测不同卵白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝法卵白定量
毛病：
与荧光卵白质定量等法子比拟，属于化学呈色法的BCA法探测精巧度尚不足
蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定完毕
BCA卵白定量和Bradford法卵白定量的差别：
1、Bradford法测得的主如果碱性氨基酸和馨香族氨基酸，BCA则没有抉择性
2、BCA法卵白浓度定量是二价铜离子在碱性的前提下，也许被卵白质复原成一价铜离子（biuretreaction），一价铜离子和特殊的BCASolutionA（含有BCA）互相影响孕育敏锐的颜色反映。两分子的BCA螯合一个铜离子，孕育紫色的反映复合物。该水溶性的复合物在nm处显示剧烈的吸光性，吸光度和卵白浓度在精深领域内有精良的线性瓜葛，因而按照吸光值也许盘算出卵白浓度。
3、Bradford法卵白定量是染料与卵白质连系后引发染料最大摄取的改动，从nm变成nm，光摄取补充。卵白质染料复合物具备高的消光系数，因而大大提升了卵白质测定的精巧度，最低检出量为1μg卵白。染料与卵白质的连系是很飞快的经过，大抵需2min，连系物的颜色在1h内是波动的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物资不骚扰测定，而大批的去污剂如TritonX，SDS等严峻骚扰测定，少许的去污剂可经过用合适的对比而消除。由于染色法浅显飞快，骚扰物资少，精巧度高，现已精深运用于卵白质含量的测定。
考马斯亮蓝法测定卵白浓度一、实行道理
考马斯亮蓝G比色法，也被称为Bradford法是罕用的一种卵白质浓度的测定法子。考马斯亮蓝G是一种染料，能与卵白质经过疏水影响连系，孕育卵白质-染料复合物，颜色由赤色转换成蓝色，最大光摄取波长为nm，而且在低浓度领域（0.01~1.0mg/mL）内，与卵白质浓度的瓜葛从命比尔定律。
二、实行材料
1、实行设施电子天平、分光光度计、恒温水浴锅
2、试剂考马斯亮蓝G、牛血清卵白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸
三、职掌环节
（一）试剂配制
1、考马斯亮蓝G溶液配制
的确称取0.1g考马斯亮蓝G，溶于50mL95%乙醇，参预mL85%磷酸，结尾用蒸馏水稀释定容到0mL。
备注：考马斯亮蓝G溶液的用量mL充分。
2、牛血清卵白溶液配制
的确称取50mg牛血清卵白，参预0.gNaCl，溶于少许蒸馏水中，而后稀释定容到mL，配制成浓度为μg/mL的牛血清卵白原液。
（二）准则弧线的制做
1、取5-7支试管，离别的确配制不同浓度梯度的牛血清卵白溶液（浓度节制在10~μg/mL领域内）1mL，详细职掌：取-μl牛血清卵白原液，水补足到1mL，浓度相当于所取原液量的格外之一；
2、在不同浓度的1mL牛血清卵白溶液中，离别参预5mL考马斯亮蓝溶液，搀杂平匀，置于25℃水浴保温10min；
3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对比，冷却后测定波长nm处的吸光值；
4、以配制的准则卵白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制做准则弧线，并做线性回归解析，求线性方程。
（三）宗旨样本的卵白浓度测定
取宗旨卵白样本按准则弧线法子测定A。根据线性方程计划宗旨样本的卵白质浓度。
四、注重事故
1、染料-卵白复合物孕育受温度和功夫影响较大，反映需节制在统一前提下实行。
2、比色杯易受蓝色玷污，应注重用乙醇冲洗。
双缩脲法测定卵白浓度一、实行道理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经℃左右加热，放出一个分子氨后取得的产品。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4孕育紫色络合物，称为双缩脲反映。凡具备两个酰胺基或两个直接衔接的肽键，或能过一此中央碳原子相接的肽键，这种化合物都有双缩脲反映。紫色络合物颜色的深浅与卵白质浓度成正比，而与卵白质分子量及氨基酸成份无关，故可用来测定卵白质含量。测定领域为1-10mg卵白质。骚扰这一测定的物资重要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的益处是较倏地，不同的卵白质孕育颜色的深浅相近，以及骚扰物资少。重要的毛病是精巧度差。因而双缩脲法罕用于需求倏地，但并不需求格外详细的卵白质测定。
二、试剂与器械
1.试剂：
①准则卵白质溶液：用准则的结晶牛血清洁卵白（BSA），配制成10mg/ml的准则卵白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A为0.66来校对其纯度。若有需求，准则卵白质还可预先用微量凯氏定氮法测定卵白氮含量，计划出其纯度，再按照其纯度，称量配制成准则卵白质溶液。
②双缩脲试剂：称以1.50g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6-4H2O），用ml水熔解，在搅拌下参预ml10%NaOH溶液，用水稀释到1L，蕴藏于塑料瓶中（或内壁涂以白腊的瓶中）。此试剂可长功夫保管。若蕴藏瓶中有黑色沉没浮现，则需求从新配制。
2.器械：
看来光分光光度计、大试管15支、漩涡搀杂器等。
三、职掌法子
1.准则弧线的测定：取12支试管分两组，离别参预0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml的准则卵白质溶液，用水补足到1ml，而后参预4ml双缩脲试剂。充足摇匀后，在室温（20～25℃）下安置30分钟，于nm处实行比色测定。用未加卵白质溶液的第一支试管做为空白对比液。取两组测定的平衡值，以卵白质的含量为横坐标，光摄取值为纵坐标绘制准则弧线。
2、样本的测定：取2～3个试管，用上述一样的法子，测定未知样本的卵白质浓度。注重样本浓度不要超越10mg/ml。
Anm紫外光摄取法测定卵白浓度一、测定道理
卵白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环机关，在紫外nm波益处有最大摄取峰，其光摄取值与卵白质浓度成正比，故也许用nm波长摄取值巨细来测定卵白质含量。
益处：
1.倏地；2.对卵白质无毁坏性。
毛病：
1.不是矜重的定量法子。由于此法是按照酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强摄取值来测定的，不同的卵白质具备不同的消光系数。别的，当卵白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该法子就不能检出卵白。
2.核酸可引发剧烈骚扰。
精巧度：
0.2mg/ml~2mg/ml；比色杯最小衡量体积为0.1ml。
注重事故：
1.实行室常常觉得用1cm的比色杯所测光摄取值为1.0时，卵白浓度约为1mg/ml，这是特别不详细的。
2.假设实行所用的缓冲液和水有较高的光摄取值，申明缓冲液中有骚扰物资存在。
二、衡量法子和计划公式：
关于不含核酸玷污的卵白溶液（假设样本光摄取值大于2.0，应将样本稀释至光摄取值小于2.0）：抉择卵白缓冲液做为空白对比，测定nm波益处的光摄取值，通常来讲，1AUnit≈1mg/ml(申明：此处默许卵白的A消光系数为1；关于浓度位于0.02mg/ml~3mg/ml领域以内的卵白样本而言如许，关于浓度小于0.1mg/ml的卵白样本，也许采取下列的法子预算：卵白浓度≈A/31）
关于存在核酸玷污（A/A.6）卵白溶液：抉择卵白缓冲液做为空白对比，测定nm和nm波益处的光摄取值，或nm和nm波益处光摄取值，遵照下列公式计划：span=""
卵白浓度（mg/ml）=[1.55×A]－[0.76×A]
卵白浓度（mg/ml）=A÷(27＋A/A)
宗旨：衡量纯化出来的已知卵白的浓度（或成份不明的卵白搀杂液）
环节：1、到ProtParamtool网站在线展望该卵白质的消光系数；2、用卵白buffer做对比调零后，按照阅历，将卵白溶液稀释至符合的浓度，使其nm处光摄取值位于0.5~1.0区间以内（常常试一次就可以找到妥帖的稀释比例）；3、做三次平行的衡量，纪录nm光摄取值。（三次平行指自力稀释三次，衡量三次）
计划：A/消光系数；三次平行的数据离别计划取得完毕，而后求其平衡值。
宗旨：衡量有核酸玷污的卵白溶液中卵白浓度
环节：1、用卵白buffer做对比调零后，按照阅历，将卵白溶液稀释至符合的浓度，使其nm处光摄取值位于0.5~1.0区间以内；2、做三次平行的衡量，纪录nm和nm波长下的光摄取值。（三次平行指自力稀释三次，衡量三次）
计划卵白浓度（mg/ml）=[1.55×A]－[0.76×A]；三次平行的数据离别计划取得完毕，而后求其平衡值。
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