微量法T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
在食品中，亚硝酸盐可与肉品中的肌红素结合而更安定，在食品加工业中作为保色剂，以维持肉制品的良好外观，并防止肉毒梭状芽孢杆菌的产生，提高食用肉制品的安全，但是人体长期摄入亚硝酸盐过量的食品，可诱发消化系统癌变。
测定原理：
在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物，再与N-1-萘基乙二胺形成紫红色偶氮化合物，在nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵或匀浆器、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液一：液体50mL×1瓶，室温保存。
提取液二：液体50mL×1瓶，室温保存。
提取液三：液体50mL×1瓶，室温保存。
粉剂四：粉剂mg×1支，室温保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
样品处理：
称取样品约0.2g鲜重或0.05g干重，破碎，加入0.5mL提取液一，沸水浴15min，冷却至室温，加入0.5mL提取液二，震荡摇匀，加0.5mL提取液三，用镊子加少量粉剂四（约1mg），静置30min，25℃，g离心15min，取上清液待测。
测定步骤和操作表：
分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至nm，蒸馏水调零。
操作表
注意：空白管只需测定一次。
亚硝酸盐含量计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为：y=0.x+0.，R2=0.x为标准品亚硝酸钠浓度（μg/ml）y为吸光值A。
NO2-（μg/g）=（△A-0.）÷0.×V样÷（V样÷V样总×W）×0.
=（A–0.）÷0.×1.5×0.÷W
=4.27×（△A-0.）÷W
V样总：加入提取液体积，1.5mL；V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为：y=0.x+0.，R2=0.1x为标准品亚硝酸钠浓度（μg/ml）y为吸光值A。
NO2-（μg/g）=（△A-0.）÷0.×V样÷（V样÷V样总×W）×0.
=（△A-0.）÷0.×1.5×0.÷W
=7.09×（△A-0.）÷W
V样总：加入提取液体积，1.5mL；V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。
注意事项：
试剂盒2-8℃保存。
试剂对人体有一定的危害，请穿实验服，戴手套操作。
若检测出得OD值在标准曲线范围外，请将样品进行适当的浓缩或稀释（A0.09浓缩，A1.5适当稀释）。
最低检出限为0.5μg/g。
网址：lmbio.