但是，苯酚用于从含高浓度溶质的水相溶液中抽提蛋白质时，有机相与水相会难以分离甚至会颠倒。这个问题在使用50:50的苯酚：氯仿混合物时得以缓解，因为高比重(1.47)的氯仿确保了两相的分离。
在两相交界面可收集到变性的蛋白质，脂质部分则有效进入有机相。异戊醇经常会加入到苯酚：氯仿混合物中以减少气泡的产生。
纯的苯酚是白色、清澈如水晶般的物体(m.p.43C).在空气及光中暴露后，可逐渐变红，该过程在碱性条件下可加速。碱化的苯酚不推荐使用，它需要在°C蒸馏以去除如醌类的氧化产物，因为后者会破坏核酸的磷酸二酯键或促进核酸的交联。很多制造商提供的液化形式苯酚含有约8%的水，可在-20°C冻存。
液化的苯酚如果无色可以用于分子克隆，并不需要再蒸馏。目前，只有偶尔部分批次的液化苯酚呈粉红色或黄色，这种情况可以拒绝使用并退回给制造商。在使用之前，苯酚要用水饱和，并用Tris(pH7.8)平衡，目的是阻止在酸性pH中DNA进入有机相。
1.将样品转移至聚丙烯管中，加入等体积的苯酚：氯仿。如果苯酚未平衡到pH7.8~8.0,DNA会容易进入有机相。
2.混匀管中内容物直到呈现乳状液形式。
3.在室温条件下，采用管所能承受的最大转速的80%进行离心混合液。如果有机相和水相未能很好地分开，可再离心较长时间。正常情况下，水相在上层。但水相如果含有盐(0.mol/L)或蔗糖10%)，比重会变大，因此就会在下层。