4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）
产品货号：BA
产品规格：50管/48样
产品简介
4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:CoAligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在nm下测有特征吸收峰，测定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反应4CL活性。
产品内容：
溶液的配制：
1.提取液：内含不溶物，使用前摇匀；
2.试剂二：临用前加入6mL蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3.试剂四：临用前用6mL蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；
4.试剂五：加入1mL蒸馏水溶解，临用前用蒸馏水稀释40倍后备用，现用现配；
5.工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1的比例配制工作液，现用现配。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤（仅供参考）：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（个）：提取液体积（mL）为~：1的比例（建议万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或W，超声3s，间隔10s，重复30次）；g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1.紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2.操作表（在1.5mLEP管中进行下列操作）：
三、4CL活计算
1.按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/mgprot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T
=15.87×ΔA÷Cpr
2.按样本质量计算：
单位定义：每g组织每分钟生成1nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/g质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(W×V样÷V样总)÷T
=15.87×ΔA÷W
3.按细菌或细胞数量计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(×V样÷V样总)÷T
=0.×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数，2.1×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；：细菌或细胞总数，万；：单位换算系数，1mol=nmol。
注意事项：
1.若ΔA大于0.5，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2.建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。