醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

一、目的：

1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法

2、学会常用电泳的使用方法

3、了解用醋酸纤维薄膜作支持物的优点及使用范围

二、原理：

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电物质在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH7.5以下。将血清置于pH8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。血清蛋白质的等电点和分子量见下表。

蛋白质名称

等电点（pI）

相对分子质量

占总蛋白百分数（%）

清蛋白

4.88

52-72

α1-球蛋白

5.00

2-5

α2-球蛋白

5.06

4-9

β-球蛋白

5.12

～

6.5-12

γ-球蛋白

6.85～7.50

～

12-20

本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约μm，具有一定的吸水性。

三、器材：

电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。

实验材料

醋酸纤维薄膜（2×8cm）、培养皿、粗滤纸、镊子、点样器（玻璃片、载玻片）、直尺、铅笔、剪刀等。

四、试剂：

1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克，溶于毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至毫升。2．染色液

（1）丽春红S染色液：称取丽春红SO.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀释至ml。

（2）氨基黑10B染色液：称取氨基黑（C22H13O12N6S3Na3）10B0.1g,溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水杨酸2.5g，溶于少量的蒸馏水中，加入前液将两液混合摇匀，再以蒸馏水补足至ml。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至毫升。

3．漂洗液。

（1）3％（V／V）醋酸溶液：适用于丽春红S染色的漂洗。

（2）甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀，适用于氨基黑10B染色的漂洗。

4．透明液取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。5．洗脱液

（1）0.1mol/LNaOH溶液：用于丽春红S染色的洗脱。

（2）0.4mol/LNaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脱。

6．40%(V／V)醋酸溶液。

五、操作：

1、电泳槽的准备将巴比妥－巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中（两侧槽内注入等量的缓冲液），调节两侧内的缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架的距离约为2～2.5cm。支架宽度到恰好适合CAM的长度，用3～4层滤纸或4层纱布搭桥。

2、CAM准备取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的无光泽面（涂有醋酸纤维素）距一端1.5cm处用直尺和铅笔轻划一线（与CAM的长轴垂直），作点样标记，将膜条编号后将无光泽面朝下浸入巴比妥－巴比妥钠缓冲液中，待充分浸透后取出（一般约需求20～30min），夹于洁净的滤纸中,吸去多余的缓冲液.

3、点样用血清加样器将3－5ul无溶血的新鲜血清均匀地点在划线处，样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中的蛋白区带变形。待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。

4、平衡将已点样的薄膜加样面朝下，点样端置于阴极端，将膜条紧贴于电泳槽支架的盐桥上并保持平直，桥的另一端垂入缓冲液中，盐桥将膜的两端与缓冲液连通，加上槽盖平衡5min后通电电泳。

5、电泳正确联接电泳槽与整流器对应的正负极，点样侧接负极，另一侧接正极。开启电源通电。调节电压10V～15V/cm膜长,电流0.4～0.6mA/cm膜总宽，电泳40－60分钟（通常夏季需45min,冬季需60min），待电泳区带展开3.5cm～4cm时即可关闭电源。

6、染色通电完毕，立即取出薄膜直接浸入丽春红S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分钟。

7、漂洗至少准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景漂白为止。此时清晰可见5条色带。待干。

8、定量

（1）洗脱比色法取六支试管，分别标明“A、α1、α2、β、γ、空白”。将漂洗净的薄膜剪下各区带放入相应的试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，根据染色不同按以下方法洗脱。

①氨基黑10B染色洗脱：6支试管于清蛋白管内加入0.4mmol/LNaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振摇数次，置37℃水浴20分钟，使色泽完全浸出。用nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

②丽春红S染色洗脱：洗脱液用0.1mmol/L氢氧化钠溶液，加入量同上。10分钟后，于清蛋白管内加入40％（V／V）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使溶液色泽加深。如出现沉淀，可离心取上清液比色。用nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

（2）光密度扫描法

①透明：将已漂净吹干的CAM条浸入透明液中3～5分钟，取出平铺于洁净干燥玻片上（应无气泡），直立片刻除去过多的透明液。于90～℃烘箱内烘烤5～10分钟，取出冷却至室温。此法透明的CAM，各蛋白区带鲜明，薄膜平整，可直接扫描或作永久保存。若用十萘氢或液体石醋透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易发生皱折。

②扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路，选择波长nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对含量。

9、计算

定量计算时，先计算各光密度值的总和：再计算血清各部分蛋白质所占的百分率

吸光度总和（T）＝2A＋α1＋α2＋β＋γ（吸光度）

血清各蛋白组分的相对百分数＝Ax/AT×％

Ax表示各球蛋白组分（2A＋α1＋α2＋β＋γ）的吸光度。

A％＝2A/T×％β＝β/T×％

α1％＝α1/T×％γ％＝γ/T×％α2％＝α2/T×％

各组分蛋白质含量（g/L）＝(各组分蛋白百分数(%)×血清总蛋白g/L)/

10、临床意义

（1）血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为：

蛋白质组分g/L占总蛋白百分比(%)

　　白蛋白35～.0～68.0

α1球蛋白1.0～4.01.0～5.7

α2球蛋白4.0～8.04.9～11.2

β球蛋白5.0～10.07.0～13.0

γ球蛋白6.0～13.09.8～18.2

（2）临床意义

电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。

肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等，图型表现为Alb降低，α2和β升高；肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等，图型表现为Alb降低，β和γ增高，可出现β与γ难以分离而连接在一起的“β－γ”桥，此现象是由于肝脏纤维增生导致IgA增高所致；急性反应时相型常以α1、α2增高为特征；慢性炎症型则以Alb降低，α2、γ增高较为常见；M蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤，病人有大量单克隆蛋白质（主要是IgG或IgA），电泳时可在β和βγ之间出现一条峰形狭窄的区带，称M区带。

1）电泳槽两边的缓冲液要在同一水平面，防止通过薄膜时出现虹吸现象，影响蛋白质分子的泳动速度。

2）不同实验正负极接的位置可能不一样，但是电泳原理都是一样的，都是让带负电荷的蛋白质分子移向正极。

3）醋纤膜两侧的纱布一定要上下双层噢！（得分点鸭）

4）样品点样点在粗糙面(无光泽面)，确保样品能吸人膜内。点样距离膜一端稍远一些（1.5-2cm），摆放时注意不要被纱布包裹。

5）电泳时将点样的粗糙面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。

1．通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。

2．每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，以使缓冲液的PH维持在一定水平。

3．电泳缓冲液的液面要保持一定的高度，过低可能会出现γ球蛋白的电渗现象（γ球蛋白向阴极移动），同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。

4．电泳失败或图谱不理想的常见原因

（1）电泳图谱不整齐或蛋白各组分分不佳：点样过多；点样不均匀、不整齐；薄膜过湿，样品扩散；点样速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正，歪斜、弯曲，与电流方向不平行；样品不新鲜；电流过低；CAM质量不好，薄膜结构过分细密，透水性差，导电差等。

（2）染色后白蛋白中间着色浅：染色时间不够或染色液陈旧；白蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。

（3）电泳速度慢：电流过低；供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄；温度过低；薄膜结构过分细密，透水性差，导电差；缓冲液水分蒸发，致使离子强度增大。

（4）薄膜透明不完全：透明液陈旧；浸泡时间不足；烘箱温度未到90℃即把薄膜放入。

5．染料问题：各种染料对血清各组分有不同的亲和力，大多数染料对白蛋白的亲和力大于球蛋白。如氨基黑10B对球蛋白的结合力为白蛋白的80％，因此常导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。用丽春红S染色，效果优于氨基黑10B。丽红是一种指示剂，PH＜10时呈红色，PH＞12.5时呈紫色。在酸性溶液中它的最大吸收峰在nm左右，呈对称性。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合，而氨基黑10B则对白蛋白染色过深，区带中容易出现着色不全的小点，不够理想。

6．样品要求点在粗糙面（无光泽面），否则样品很难吸入膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。

7．标本应新鲜，不得溶血。溶血标本会使β球蛋白假性升高，因血红蛋白电泳位置在β球蛋白区域内。

1、识别标记：将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用铅笔划一线，以标明点样位置。

2、浸泡：用镊子将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上(缓冲液盛于培养皿中)，使膜条自然浸湿下沉。大约10min。

3、点样：取出薄膜，用滤纸将表面的明水吸干，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上），将盖玻片先在小培养皿中的血清中沾一下，再在距膜条一端2cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

醋酸纤维薄膜电泳装置示意图

(1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板)

4、电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲溶液内。用缓冲溶液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥）。点样端靠近负极，盖严电泳室，V，45min。

5、染色：将膜条取出，放在显色液中显色10min。

6、漂洗：将膜条放在漂洗液中漂洗数次，至底色脱净为止，可得到清晰电泳图谱。

六、注意事项：

1、点样要少、轻、直、匀

2、不要将薄膜吸得过干

3、漂洗时不要用镊子来回拉动

4、节约漂洗液

七、结果与分析：

将图谱画在报告纸上，注明各种蛋白顺序，并分析结果

八、临床意义

血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分,含量为60～80g/L,绝大部分由肝脏合成,仅γ球蛋白由浆细胞合成正常值:

白蛋白57%—72%

α1球蛋白2%—5%

α2球蛋白4%—9%

β球蛋白6.5%—12%

γ球蛋白12%—20%

血浆蛋白的主要功能:

维持血浆胶体渗透压

调节血浆pH值,维持酸碱平衡

运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等免疫作用

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。

疾病情况下血清蛋白质可呈现多种变化

血清蛋白图谱类型

总蛋白质

清蛋白

α1

α2

β

γ

肾病型

↓↓

↓↓

↑

↑↑

↑

不定

肝硬化型

↓N↑

↓↓

N↓

↓N

↑

↑

注：N代表正常。

习题

1.血清蛋白质的等电点大都在pH7.0以下，故在pH8.6的缓冲液中都带有——电荷，在电场中向————极移动。

2.使用醋酸纤维薄膜进行电泳试验，血清样品点在醋膜的————面上，将膜放入电泳槽时醋膜的————向上。

3.为了确保良好的电泳效果，在接通电源之前，槽中的醋酸纤维膜必须整张变得————。

4.血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳试验可将蛋白质由正极向负极依次分成_______、α1球蛋白、α2球蛋白、_______、γ球蛋白，五条区带？

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