糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。总糖也可称为碳水化合物,主要指具有还原性的葡萄糖,果糖,戊糖,乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖,麦芽糖以及可能部分水解的淀粉,包括可溶性的单糖,二糖以及不溶性的淀粉,纤维素,几丁质等。
测定原理:
总糖酸水解为还原糖,在NaOH和丙三醇存在下,DNS试剂与还原糖共热后被还原成氨基化合物,在过量的NaOH碱性溶液中呈桔红色,在nm处有最大吸收峰,以此测定样品中的总糖含量。
需自备的试剂和器材:
1.可见分光光度计/酶标仪
2.37℃恒温箱
3.系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器
4.去离子水或蒸馏水
产品组成:
实验步骤:
一、试剂准备
标准品:临用前加1mL蒸馏水溶解为10mg/mL的葡萄糖标准品备用,2-8℃可保存两周。
二、样本处理
1、组织样本的处理:称取约0.1g样本于10mLEP管中,加入1mL试剂R1,1.5mL蒸馏水,研磨匀浆,沸水浴30min,加入1mL试剂R2,涡旋混匀,用蒸馏水定容至10mL,g,25℃离心10min,取上清液待测。(注意稀释)。
2、血清(浆)、液体样本的处理:取0.1mL血清(浆)于1mLEP管中,加入0.1mL试剂R1,0.15mL蒸馏水,匀浆,沸水浴30min,加入0.1mL试剂R2,涡旋混匀,用蒸馏水定容至1mL,g,25℃离心10min,取上清液待测。(注意稀释)。
三、测定步骤
1、酶标仪/分光光度计预热30min以上,调节波长至nm,蒸馏水调零。
2、标准品准备
将标准品用蒸馏水按梯度进行稀释,最大浓度为1mg/mL,标准液稀释可参考下表:
备注:实验中每个标准管需uL标准溶液。
3、加样表
涡旋混匀,在nm下测定吸光值,分别记为A空白管、A测定管、A标准管。计算△A测定=A测定管-A空白管、△A标准=A标准管-A空白管。标准曲线和空白管只需测1-2次。
四、总糖含量计算
1、标准曲线的绘制:
根据标准管的浓度(x,mo/mL)和吸光度△A标准(y,△A标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将△A测定(y,△A测定)带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。
2、按样本质量计算
总糖(mg/g质量)=(x*V样总)÷W*稀释倍数=10*x÷W*稀释倍数
3、按血清(浆)、液体体积计算
总糖(mg/mL)=(x*V提)÷V样*稀释倍数=10*x*稀释倍数
V样总:样本体积总体积,10mL;
W:样本质量,g;
V提:液体或血清样本总体积,1mL;
V样:液体或
血清体积,0.1mL。
注意事项:
1、此试剂盒对千纤维素的分解程度无法达到%。
2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。