肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）
产品货号：BA
产品规格：50T/48S
产品简介：
C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中，属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP，在nm下测定NADPH的减少速率，即可反映C4H活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
溶液的配制：
1.试剂二：临用前加入3mL乙醇溶解备用。2-8℃保存4周。
2.试剂三：临用前每瓶加入3mL双蒸水充分溶解待用。现配现用。-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可参考文献）
1.组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。g4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
2.细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）。g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1.紫外分光光度计预热30min，波长调至nm，蒸馏水调零。
2.加样表（在1mL石英比色皿中分别加入）：
充分混匀后立即测定10s时在nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A1-A2。
三、C4H酶活计算
1.按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmolNADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H酶活（U/mgprot）=[ΔA÷(ε×d)××V反总]÷(V样×Cpr)÷T=.91×ΔA÷Cpr
2.按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmolNADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H酶活（U/g质量）=[ΔA÷(ε×d)××V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T=.91×ΔA÷W
3.按细胞或细菌个数计算：
单位的定义：每个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmolNADPH的酶量定义为一个酶活性单位。
C4H酶活（U/cell）=[ΔA÷(ε×d)××V反总]÷(÷V提取×V样)÷T=1.×ΔA
V反总：反应总体积，0.L；ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入的样本体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；：万个细胞；T：反应时间，3min；：单位换算系数，1mol=nmol。
注意事项：
当ΔA大于0.4时，建议将样本用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样本体积来测定。
实验实例：
1.取0.1g黄豆（发芽）加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算
ΔA=A1-A2=1.-1.=0.，按样本质量计算酶活得：
C4H酶活（U/g质量）=.91×ΔA÷W=.91×0.÷0.1=.76U/g质量。