色氨酸合成酶的提取和活性测定上海液质检

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色氨酸合成酶在磷酸吡哆醛的存在下,可催化丝氨酸与吲哚生成色氨酸,而色氨酸则是植物体内生物合成生长素(IAA)的前体。

其反应式如下:

1.仪器设备

研钵、分光光度计、低温高速离心机、一般离心机和纸层析设备等。

2.操作方法

1)酶的提取:材料可用豌豆苗、烟草愈伤组织等。豌豆苗或烟草愈伤组织经冰冻后,放置在预冷过(-15℃)的研钵中,加干净的石英砂和少量磷酸缓冲液(pH7.0)在3℃下研磨,匀浆用×g离心30~60min(0℃),上清液供测酶活性。

2)酶活性的测定

(1)在13mm×mm的试管中,加0.3ml的60mmol/Ldl-丝氨酸,0.04ml的0.2mmol/L吲哚,0.16ml的80mmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.5),0.1ml含有10mg的磷酸吡哆醛,0.4ml酶提取液,再加重蒸馏水至最后体积为1.0ml,在30℃水浴中保温min。然后加0.2ml的5%NaOH中止反应。对照管中不加丝氨酸或不加酶提取液。

(2)没有反应的吲哚残留物的测定可采用以下方法,即加3ml甲苯于试管中,摇匀,低速离心1min,溶液明显地分成两层,取1ml甲苯层提取液于干净试管中,加4ml95%乙醇和2ml的Ehrlich试剂(9g对二甲基氨基苯甲醛加入45ml浓盐酸,并用95%乙醇配成ml,摇匀),30~60min后,在nm处比色测定。同时取1ml纯甲苯加乙醇和Ehrlich试剂作空白对照。用0.2mmol/L吲哚作标准曲线。然后根据与未加酶液的对照比较计算吲哚的消失量。

(3)色氨酸的生成量也可以用纸层析法测定,将上述反应液在30℃温度下保温2h,每管用10ml重蒸馏水透析3次,再将30ml透析液于30℃以下减压抽干,残留物溶于0.5ml的90%甲醇,用WhatmanNo.3滤纸进行层析,层析时的展层剂为异丙醇-氨水-水(80:5:15,v/v),上行30cm中止,取出滤纸,干燥后,用Ehrlich试剂喷雾显色。吹干后,剪下斑点,用一定量的甲醇洗脱,洗脱液于nm处比色测定。同时用不含丝氨酸但含1mmol/L的L-色氨酸的反应液,依同样操作作对照。用已知的L-色氨酸作标准曲线。

3.注意事项

有关色氨酸合成酶的提取和测定,也可采用DelmerDP等方法(PlantPhysiol.,,43:81)。色氨酸的比色测定可参考《蛋白质化学研究技术》一书(潘家秀等编著。科学出版社。,30)。




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