蛋白质测定的原理和方法
一、粮油及其制品中蛋白质的测定
蛋白质的测定方法一般是根据蛋白质的理化特性来确定的，主要分为两类：一类是利用蛋白质共性的方法，例如凯氏法、双缩脲法等；另一类是利用蛋白质中含有特定氨基酸残基的方法，例如酚试剂法、紫外光谱吸收法、色素结合法等。
在粮食品质分析中应用最普遍的是凯氏法。该法是年由丹麦化学家凯道尔创立的，适宜于测定任何形态的样品，而且具有很高的准确度和精密度，一直被作为蛋白质定量的标准方法。近几年来对凯氏法进行了多方面的改进，目前正向自动检测方面发展。
1、常量凯氏定氮法
1）原理：将含有蛋白质的样品与浓H2SO4共热，其中的氮变成铵盐状态后再与浓碱作用，放出的氨用酸吸收，滴定剩余的酸，即可算出含氮量。具体测定步骤可用消化、蒸馏、吸收与滴定来概括。
消化是指将蛋白质与浓H2SO4混合加热，蛋白质被分解，其中的碳被氧化成CO2，所含的氮则转变成氨，并与H2SO4化合形成硫酸铵残留于消化液中。
2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4＝（NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O
由于上述反应进行很慢，消化需要很长时间，加入催化剂可加快反应速度，CuSO4是常用的催化剂，K2SO4能提高溶液的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化、促进有机物分解的作用。K2SO4的用量不宜过大，否则温度过高，生成的（NH4）2SO4会分解，放出氨，使氮损失。
蒸馏是将消化所得的（NH4）2SO4加碱蒸馏，氨又被释放出来。
2NaOH＋（NH4）2SO4＝2NH3＋Na2SO4＋2H2O
需要注意的是加入NaOH溶液要过量，而且要防止样液中NH3的逸出。可用CuSO4作碱性指示剂，以黑色CuO出现为宜
吸收与滴定是将生成的氨用标准HCl吸收，剩余的未被中和的HCl则用标准NaOH溶液滴定。所用HCl的摩尔数减去滴定所消耗的NaOH的摩尔数，就是被吸收氨的摩尔数
生成的氨也可直接用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂的颜色变化，再用HCl滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，用去HCl的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数
2NH3＋4H3BO3＝（NH4）2B4O7＋5H2O
（NH4）2B4O7＋5H2O＋2HCl＝2NH4Cl＋4H3BO3
由于各种蛋白质中氮的质量分数通常为16%左右，将氮的质量分数乘以蛋白质系数，即得粗蛋白质的质量分数。
2）仪器：凯氏烧瓶（ml）、锥形瓶（ml）、定管（50ml）、移液管（50ml）、量筒（ml）、定氮蒸馏装置
3）试剂：浓、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份1g/l溴甲酚绿乙醇溶液与1份甲基红乙醇溶液，按5：1体积临用时混合、40g/l硼酸吸收液：称取20g硼酸溶解于ml热水中，摇匀备用、0.0mol/LHCl标准溶液
4）操作方法
准确称取固体样品0.2~2g（半固体样品2~5g，液体样品10~20ml），小心移入干燥洁净的ml凯氏烧瓶中，加入研细的CuSO40.5g，K2SOg和浓H2SOml，轻轻摇匀，安装消化装置，并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后，加大火力，使瓶内液体微沸，液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。冷却，小心加入ml蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。
将凯氏瓶安装好蒸馏装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入50ml40g/l硼酸吸收液及混合指示剂2~3滴）。放松夹子，通过漏斗加入70~80mlg/LNaOH溶液，并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀后，再加入ml蒸馏水（从漏斗中加入），夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约ml即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，若无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。否则应继续蒸馏。将上述吸收液用0.0mol/LHCl标准溶液直接滴定至灰色即为终点，记录HCl标准溶液的用量。同时做空白试验（除不加样品外，其他操作完全相同），记录空白试验消耗HCl标准溶液的体积。
5）结果计算
蛋白质质量分数的计算公式为w（蛋白质）＝〔M×F×c(v1－v2)×〕/（0×m）＝〔F×c(v1－v2)×1.4〕/m式中：w(蛋白质)——蛋白质的质量分数（%）m——样品的质量（g）M/14——氮的摩尔质量（g/mol）c——HCl标准溶液的浓度（mol/L）v1——滴定样品吸收液时消耗HCl标准溶液的体积（ml）v2——滴定空白吸收液时消耗HCl标准溶液的体积（ml）F——氮换算为蛋白质的系数
蛋白质中氮的质量分数一般为15~17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质的质量分数。蛋白质系数：乳制品为6.38；肉及其制品为6.25；玉米、高粱为6.24；米为5.95；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；大豆及其制品为5.71；面粉为5.70；花生为5.46；芝麻、向日葵为5.30
6）注意事项
蒸馏装置不能漏气；蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色，不生成Cu（OH）2沉淀，此时需增加NaOH的用量；硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸；所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫逸出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；也可以加入少量的辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度；当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%（体积分数）H2O22~3ml后再继续加热消化；若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加H2SO4用量；一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需延长消化时间。有机物若分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色；混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
2、微量凯氏定氮法
1）原理：同常量凯氏定氮法
2）仪器和用具：凯氏烧瓶（ml）、万用电炉、微量滴定管（10ml）、移液管（10ml）、容量瓶（ml）、洗耳球、乳胶管、微量凯氏定氮蒸馏装置
3）试剂：0.00mol/LHCl标准溶液：其他试剂同常量凯氏定氮法
4）操作方法：样品消化步骤同常量凯氏定氮法
将消化完全的溶液冷却后，全部移入ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。装好微量定氮装置。量取消化稀释液10ml置于反应管内，经漏斗再加入10mlg/LNaOH溶液使其呈强碱性，用少量蒸馏水冲洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10ml40g/l（或20g/l）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管下端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用0.00mol/LHCl标准溶液滴定至灰色为终点。同时做空白试验。
5）结果计算
样品中蛋白质质量分数的计算公式为
w（蛋白质）＝｛〔F×c(v1－v2)×14×〕/0｝/〔（10×m）/〕
＝F×c(v1－v2)×14/m式中：w(蛋白质)——样品中蛋白质的质量分数（%）m——样品的质量或体积（g）14/M——氮的摩尔质量（g/mol）c——HCl或H2SO4标准溶液的物质的量的浓度（mol/L）v1——样品消耗HCl或H2SO4标准溶液的体积（ml）v2——试剂空白消耗HCl或H2SO4标准溶液的体积（ml）F——氮换算为蛋白质的系数
6）说明
20g/L硼酸吸收液每次用量25ml，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴；在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸；加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失；双试验结果允许误差：粗蛋白质的质量分数在15%以下时，不超过0.2%；蒸馏前将水蒸气发生器内装水至2/3体积处，加甲基橙指示剂数滴及H2SO4数毫升以使其始终保持酸性，可避免水中的氨被蒸出而影响测定结果；粗蛋白质的质量分数在15%以上时，误差不超过0.4%。求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位。
二、饮料中蛋白质的测定
1、原理：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。
2、仪器：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。
3、试剂：同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。
4、测定方法：准确吸取饮料样品10~20ml，移入干燥洁净的ml凯氏烧瓶中，加入研细的CuSO40.5g、K2SOg和浓H2SOml，轻轻摇匀，安装消化装置，并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。冷却，加入ml蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。
原文