木聚糖酶(EC3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应用于酿造和饲料工业中,中性木聚糖酶(NEX)一般分离自适生长pH为6-8的微生物。
测定原理:中性木聚糖酶(NEX)在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在nm处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在nm吸光值增加速率,可计算中性木聚糖酶(NEX)活力。
需要的仪器,耗材:
1、可见分光光度计/酶标仪
2、台式离心机
3、可调式移液器
4、微量石英比色皿/96孔板
5、研钵、冰和蒸馏水。
产品组成:实验步骤:一、样本处理(具体比例可以参考文献)
1、细胞或微生物样本发酵液的制备:发酵液于rpm,4℃,离心15min,取上清,置于冰上待测。
2、组织:称取约0.1g组织,加入1mL缓冲液,冰上充分研磨。g,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。
3、酶干粉:称约1mg,加缓冲液1mL,震荡充分溶解。
二、试剂准备标准品:10mg木糖。临用前加入uL蒸馏水配成umol/mL的标准品溶液,2-8℃保存两周。三、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至nm,可见分光光度计蒸馏水调零。
2、标准液
取20uLumol/mL木糖标准液,加入uL蒸馏水,充分混匀,配制成4umol/mL的木糖标准液备用,现用现配。
备注:实验中每管需要75uL,为减小实验误差,故配制大体积。
3、将上清液/酶溶液用蒸馏水稀释十倍后置冰上待测(即取50uL上清液/酶溶液,加入uL蒸馏水,充分混匀)。
四、NEX计算公式
1.发酵液NEX活力计算:
酶活定义:50℃,pH60条件下每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX活力(U/mL)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]÷T
2.酶干粉NEX活力计算:
酶活定义:50℃,pH60条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX活力(U/mg)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本xW酶÷V提取)÷T
3.组织中NEX活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:50℃,pH60条件下,每mg组织蛋白每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX活力(U/mgprot)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本xCpr)÷T
(2)按样本质量计算:
酶活定义:50℃,pH60条件下,每g组织每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX活力(U/g质量)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本*W÷V提取)÷T
C标准:木糖标准溶液,4umol/mL;
V样本:加入的样本体积,0.05mL;
W酶:酶干粉的质量,mg;
T:反应时间,30min;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;
W:组织样本质量,g;
V提取:加入缓冲液的体积,1mL;
10:样本稀释倍数。
注意事项:
吸光度变化应该控制在0.01~1.5之间,否则加大样本量或稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变;也可以延长或者缩短反应时间。