博大富菌素是我公司与华中农业大学、农业微生物学国家重点实验室联合开发的最新技术的丁酸梭菌产品，优选高产丁酸梭菌素菌株，采用独特的后处理工艺最大限度地保留丁酸梭菌代谢产物，保证其在进入肠道后以最快的速度发挥生理作用。
你所不知道的丁酸梭菌（二）
摘要：试验旨在筛选高产丁酸梭菌素的丁酸梭菌，为其在动物生产中的应用奠定基础。采用厌氧培养法进行菌种分离，孔穴琼脂扩散法及丁酸梭菌素活性测定进行抑菌活性筛选，并通过形态学、生理生化特性和16sDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。结果表明：从盲肠内容物中分离到18株丁酸梭菌编号为BD-BD，其中6株对产气荚膜梭菌具有明显抑制作用，丁酸梭菌素活性单位-AU不等。其中目标菌株BD经鉴定结果为丁酸梭菌。本次获得的丁酸梭菌BD及其代谢产物丁酸梭菌素作为潜在的抗生素替代物具有一定的开发价值。关键词：盲肠丁酸梭菌丁酸梭菌素生物学特性
1材料与方法
1.1材料与试剂仔猪盲肠内容物10份，肉鸡盲肠内容物10份，取自华中地区5个猪场5个鸡场；产气荚膜梭菌ATCC；梭菌增殖培养基（RCM培养基）、梭菌选择性培养基（TSN培养基）、LB肉汤培养基、LB琼脂培养基；细菌生化微量反应管；细菌DNA提取试剂盒；
1.2试验方法
1.2.1分离培养方法采用厌氧试剂盒来进行厌氧菌的液体培养、分离和平板培养。取盲肠内容物10g加入到90mLPBS培养基中，放入80℃水浴10min以杀死非芽孢细菌，放入RCM培养基于37℃厌氧培养24h；将样品稀释后涂布于TSN培养基上，37℃厌氧培养24h。选取严格厌氧生长的菌株，进行镜检；根据丁酸梭菌的菌落形态及显微镜形态等特征，挑选符合特性的菌株进行生理生化鉴定和16SrDNA序列分析。
1.2.2产抑菌蛋白的丁酸梭菌筛选
发酵上清菌液：分离的菌株在RCM液体培养基中厌氧培养24h作为种子液，种子液按2%接种于新的RCM液体培养基中，37℃静置培养24h作为发酵液，以00r/min，4℃离心10min，取上清液备用。指示菌的制备：保存的指示菌在GAM液体培养基培养24h作为种子液，种子液按2%接种于GAM液体培养基中，37℃，培养24h，备用。抑菌试验初筛：采用孔穴琼脂扩散法。接种产气荚膜梭菌至GAM培养基，培养24h后转接2%至5mLGAM液体培养基中，37℃，培养至-CFU/mL；灭菌后的mLGAM固体培养基冷却至45-50℃时，加入1‰的上述菌液，混合均匀后倾倒平板，凝固后，用打孔器（孔径）在平板上打孔，分别加入50uL发酵上清液，阴性对照加入等体积的RCM培养基，每个样品3个重复，置于37℃培养24h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。抑菌试验复筛：发酵液和指示菌培养液制备同上。对上清液进行排酸、过氧化氢酶及蛋白酶处理，孔穴琼脂法测定其抑菌活性。1.2.3丁酸梭菌素活性单位检测丁酸梭菌素活性单位（arbitraryunit，AU）：μL含1%产气荚膜梭菌ATCC的GAM肉汤（-CFU/mL），厌氧培养24h，加入μL蒸馏水在ODnm测定，为丁酸梭菌发酵液稀释度的丁酸梭菌素活性单位判定点。
1.2.3.1取发酵终点发酵液50mL，静置，取上清液过0.22mm滤膜，取过滤液备用；
1.2.3.2制备-CFU/mL产气荚膜梭菌发酵液；
1.2.3.3GAM肉汤培养基制备；
1.2.3.4取1μL-CFU/mL产气荚膜梭菌加入99μL制备好的GAM肉汤培养基；取μL含1%梭状芽胞杆菌的GAM肉汤，厌氧培养24h后，加入μL蒸馏水，测定ODnm值为判断点。
1.2.3.5预试验（缩小稀释倍数范围）
发酵上清液稀释倍数
2
20
0
含2%梭菌芽孢杆菌GAM肉汤加样量，μL
发酵上清液加样量，μL
10
1
0.1
蒸馏水加样量，μL
0
90
99
99.9
厌氧培养24h，在ODnm测定，记录包含1.2.3.4中判断点的上、下倍数值。1.2.3.6根据预试验结果在区间内做+10倍稀释，最接近1.2.3.4中判断点的倍数值N即为发酵液丁酸梭菌素的细菌素活性。1.2.4丁酸梭菌的鉴定
形态学鉴定：将目标菌株涂布于RCM培养基平板，37℃培养24h，观察菌落形态，挑取单菌进行革兰氏染色镜检。
生理生化鉴定：运用细菌微量生化反应管对菌株进行生理生化特征分析。16SrDNA基因序列分析鉴定：挑取单菌落至5mL牛肉膏液体培养基中于30℃，r/min摇床上过夜培养；12,r/min离心15s收集菌体，STE洗涤1次，再次离心，菌体重悬于1mLTE溶液中；加入50mg/mL溶菌酶溶液3μL（终浓度为μg/mL），37℃保温1～2h；加入10%SDS溶液20.5μL，60℃～65℃保温5min；加入5mol/LNaCl22.5μL（终浓度为1mol/L）；加入等体积的酚：氯仿抽提去蛋白，12,r/min离心5min，取上清于另一离心管中；上清液中加入等体积的酚：氯仿，混匀，12,r/min离心5min，取上清于另一个离心管中；加入2倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃静置30min后，12,r/min离心5min；75%乙醇洗涤2次，真空冷冻抽干后于－20℃保存备用。PCR运行程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，25/30个循环，72℃延伸10min；4℃保温10min。PCR产物的回收与纯化：参照V-gene公司的试剂盒操作手册进行。回收纯化的的PCR产物送北京三博远志公司进行序列测定，通过BLAST程序与GenBank