谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒（微量法）
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
产品货号：BA
产品规格：管/96样
产品简介：
GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时不断消耗NADPH生成NADP+；NADPH在nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定nm吸光度下降速率；来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。产品内容：
试剂一：液体mL×1瓶，4℃保存。试剂二：液体1mL×1瓶，4℃保存。试剂三：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入2.0mL蒸馏水，混匀。需自备的仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）和蒸馏水。操作步骤：
一、粗酶液提取
称约0.1g组织，加入1.0mL试剂一，冰上充分研磨，00rpm4℃离心10min，取上清液，待测。二、GR测定操作：
1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到nm，蒸馏水调零。2.试剂一置于25℃(普通物质)或者37℃(哺乳动物)中预热30min以上。3.空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，μL试剂一，于nm测定10s和s吸光度，记为A空1和A2。4.测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，20μL上清液，μL试剂一，于nm测定10s和s吸光度，记为A测1和A测2。注：样品测定10s时吸光度后，将比色皿放入25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）水浴，3min后拿出，吸打混匀，立即测定s时的吸光度。
三：GPX活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1molNADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/mgprot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(Cpr×V样)÷T
=0.×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr（2）按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样本每分钟催化1molNADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/g)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(W×V样÷V样总)÷T
=0.×(△A测定管-△A空白管)÷W△A空白管=A空1-A空2，△A测定管=A测1-A测2；ε：NADPH摩尔消光系数6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=2×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。b.使用96孔板测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmolNADPH氧化。
GR酶活(U/mgprot)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×]÷（Cpr×V样）÷T
=0.×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样品每分钟催化1μmolNADPH氧化。
GR酶活(U/g鲜重)=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×]÷(V样÷V样总×W÷T
=0.×(△A测定管-△A空白管)÷W△A空白管=A空1-A空2，△A测定管=A测1-A测2；ε：NADPH摩尔消光系数6.22×L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，μL=2×10-4L；：1mol=1×μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=2×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。注意事项：
1.样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。2.试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上。3.测定前须先用1～2个样做预实验，确保s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2～5倍。4.细胞中GR活性测定时，细胞数目须在万-万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。