1-吡咯啉-５-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书
货号：UPLC-MS-
规格：T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
溶液的配制：
1、试剂三：临用前取1支加入0.mL蒸馏水溶解，现配现用。-20℃分装保存；-20℃保存一周；
2、试剂四：临用前加入3mL蒸馏水溶解，现配现用。-20℃分装保存；-20℃保存一周。
微量法
产品说明：
在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下，均会诱导植物体内脯氨酸的积累，对植物起到保护作用。高等植物中，脯氨酸的合成有两条途径，分别以谷氨酸和鸟氨酸为前体。谷氨酸途径主要负责胁迫条件下脯氨酸的积累，而鸟氨酸途径主要在氮充足条件下起作用，与胁迫情况下脯氨酸的积累没有关系。
1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶，P5CS是一个双功能酶，在NADPH和ATP作用下，可催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸γ-半醛还原，通过测定NADPH在nm处吸光度的变化，可计算出P5CS的活性高低。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：按质量（g）︰提取液体积（mL）1︰5~10比例（建议称取0.1g样本，加入1.0mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后加入10μL提取液二，于4℃，rpm，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2、将试剂三、试剂四置于冰上待测。
3、操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中操作）
注意：空白管只需测定1-2次。三、P5CS酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmolNADPH为一个酶活单位。P5CS酶活（U/mgprot）=ΔA÷ε÷d×V反总×÷(V样×Cpr)÷T=.54×ΔA÷Cpr÷d
2、按样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmolNADPH为一个酶活单位。
P5CS酶活（U/g质量）=ΔA÷ε÷d×V反总×÷(W×V样÷V样总)÷T=.76×ΔA÷W÷d
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：微量比色皿光径，1cm/96孔UV板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1.01mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min；：单位换算系数，1mol=nmol。
注意事项：
1、当A1测定高于1.5或者ΔA大于0.5时，建议将样本稀释后检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、尽量使用新鲜样本进行检测，操作时请置于冰上操作。
3、ΔA空白管的数值一般不超过0.05。