CJTER动物模型联盟骨关节炎早期模型小

骨关节炎早期模型小鼠软骨下骨的形态学特征

背景：骨关节炎是一种以关节软骨降解和软骨下骨硬化为主要病理改变的退行性关节疾病，骨细胞在软骨下骨硬化中的作用和机制尚不明确。

目的：探讨负荷加重导致的小鼠膝骨关节炎软骨下骨的病理特点、骨矿化指标以及骨细胞形态学和骨硬化蛋白分泌水平的改变。

方法：选取10周龄的C57BL/6雄性小鼠共20只，随机分为骨关节炎组与对照组，每组各10只。骨关节炎组全麻下行前交叉韧带横切术建立膝骨关节炎模型，对照组行假手术。术后4周处死小鼠并收取膝关节样本，分别进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及国际骨关节炎研究学会评分；Micro-CT评价软骨下骨松质和软骨下硬骨板的骨矿化密度及相对骨体积分数值；扫描电镜观察骨细胞及软骨下骨板的形态学改变；免疫组化染色检测SOST/sclerostin的表达变化。

结果与结论：①苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色显示前交叉韧带横切术后4周，小鼠膝关节软骨及软骨下骨均出现明显骨关节炎表型，国际骨关节炎研究学会评分增高(P0.05)；②Micro-CT结果显示，前交叉韧带横切术后4周，膝骨关节的软骨下骨松质和软骨下硬骨板区域骨矿化密度值减少(P0.05)，而相对骨体积分数值增高(P0.05)，提示骨关节炎软骨下骨硬化是由骨矿化密度的下降和骨体积分数增高形成的；③扫描电镜结果显示，骨关节炎组小鼠膝关节软骨下骨板中的骨细胞失去正常的形态和排列方式，软骨下骨板矿化沉积形态不规则；④免疫组化染色显示，骨关节炎组小鼠膝关节中SOST/sclerostin免疫组化染色阳性细胞数明显较少，提示骨细胞形态的改变可能和骨硬化蛋白分泌水平改变有关；⑤结果表明，骨关节炎早期软骨下骨硬化主要体现为骨矿化密度值减少、相对骨体积分数值增高以及软骨下骨微观形态的不规则改变；前交叉韧带横切诱导下，在骨关节炎早期骨细胞即出现明显形态和排列的改变，分泌骨硬化蛋白的量亦受到影响。

1实验动物10周龄雄性C57BL/6小鼠共20只，平均体质量(20±3)g，购于四川大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(川)-。2实验试剂苏木精-伊红染液(上海Sigma-Aldrich贸易有限公司)，甲苯胺蓝染液(上海歌凡生物)，抗sclerostin抗体(RD公司，美国)，密抛光膜、抛光液(北京国瑞升公司)，次氯酸钠溶液(成都市科龙化工试剂厂)。3实验仪器Micro-CT(Scancoviva40，瑞士)，石蜡包埋机(德国Leica公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)，扫描电镜超声清洗机(Branson，必能信超声有限公司，美国)，体视显微镜(NIKONSMZl，日本)，扫描电镜(InspectFFEI，荷兰)。

4实验方法4.1实验设计与分组选取10周龄C57BL/6雄性小鼠共20只，称质量后将相同体质量的小鼠放入同一笼中，共计5笼(编号1#-5#)。另取空笼2只，编号为骨关节炎组和对照组。按顺序从1#-5#笼中每次取小鼠一只相继放入骨关节炎组及对照组笼中，直至骨关节炎组10只，对照组10只。两组小鼠均以右侧后肢为实验侧，骨关节炎组小鼠右侧后肢膝关节使用前交叉韧带横切术构建关节不稳定模型以诱导骨关节炎形成[9]，对照组小鼠右侧后肢膝关节行假手术[10]。术后4周处死小鼠并收取膝关节样本[11-12]，分别进行组织学染色、Micro-CT扫描、数据分析及扫描电镜观察。4.2小鼠膝关节炎模型的建立使用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)进行腹腔注射麻醉；消毒术区，备皮，于膝关节前方的皮肤处作约5mm长的纵行膝关节内侧切口。直视下分离膑腱，将膑腱(连同其中的髌骨)轻柔拨向关节外侧，用手术刀的尖端划断前交叉韧带。采用抽屉试验确认前交叉韧带是否完全切断，之后使用4-0可吸收缝线分层缝合关节腔软组织与皮肤。假手术组仅做膝关节内侧切口，不予切断前交叉韧带，之后直接以相同方法缝合关节腔软组织和皮肤。术后给予小鼠正常饮食。4.3组织病理学染色术后4周麻醉处死小鼠，获取膝关节样本，在进行组织学染色前均经过40g/L多聚甲醛溶液固定，10%EDTA溶液脱钙、乙醇梯度浓度脱水、二甲苯透明以及石蜡包埋。包埋后的组织进行连续切片，切片方向与膝关节的冠状面平行，每张切片厚4μm，切片以实验分组的顺序进行编号并作相应标记。苏木精-伊红染色步骤：切片放入二甲苯中脱蜡2次，每次10min；乙醇梯度水化每次30s；清水冲洗后，苏木精着色5min；流水洗去多余染液后用0.5%的盐酸乙醇分色；流水冲洗2min；氨水返蓝5min；流水冲洗2min；浸入伊红染色液3min；冲洗1min；体积分数75%乙醇分色2次各10s；95%乙醇脱水2次各10s；%乙醇脱水2次各30s；二甲苯透明2次各60s；中性树胶进行封固。SOST/sclerostin免疫组化染色步骤(检测骨硬化蛋白阳性细胞)：脱蜡及梯度脱水同苏木精-伊红染色；蒸馏水洗2次，每次10min；体积分数3%H2O2封闭20min；PBS洗2次，每次5min；抗原修复：切片滴加抗原修复液放入37℃恒温孵箱20min；PBS洗2次，每次5min；兔封闭血清(1∶20)封闭，37℃，30min，后甩去封闭液；切片上滴加羊抗鼠骨硬化蛋白一抗(1∶)，标记，置于4℃冰箱过夜；PBS洗2次，每次5min；生物素二抗，兔抗羊(1∶)37℃，60min；PBS洗2次，每次5min；辣根酶标记亲和素(1∶)37℃，60min；PBS洗2次，每次5min；DAB显色，镜下观察，2min后终止反应；蒸馏水洗，苏木精复染3min，盐酸乙醇分色，氨水返蓝；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；空白对照采用PBS代替一抗，其余步骤同上。甲苯胺蓝染色步骤：将干燥切片放入氢氧化钾的无水乙醇饱和溶液中浸泡10-15min，无水乙醇清洗3次；乙醇梯度水化；水洗3次，每次5min；浸染于甲苯胺蓝染液中10min；水洗去多余染液；乙醇梯度脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。根据国际骨关节炎研究学会(OsteoarthritisResearchSocietyInternational，OARSI)评分对小鼠骨关节炎模型建立后骨关节炎严重程度进行评估，以甲苯胺蓝染色中观察到的关节软骨损伤程度对各组小鼠膝关节进行0-6分(由低到高)的OARSI评分[13]。4.4Micro-CT检测各组小鼠的膝关节样本采用40g/L多聚甲醛溶液固定后，分别对整个膝关节进行Micro-CT扫描(包括胫骨和股骨各5mm，X射线管电压：70kV；电流：μA；暴露时间：ms)，每个样本扫描30个连续的断层，扫描后的数据使用配套软件进行分析，对相应区域的骨矿化密度及相对骨体积分数(bonevolume/trabecularvolume，BV/TV)值进行测量分析。Micro-CT扫描选取的检测部位分别为软骨下硬骨板及软骨下骨松质。4.5扫描电镜检测用2.5%戊二醛溶液固定样本，乙醇梯度脱水，使用环氧树脂AB胶包埋，使用梯度粒度的砂纸加水进行打磨至关节矢状面的中线处，使用梯度粒度的金刚砂液在梯度粒度的打磨纸上进行抛光，20%-37%的磷酸酸蚀，蒸馏水轻柔冲洗，用20%-37%的磷酸酸蚀样本，超声清洗、干燥，喷金后在显微镜下观察。5主要观察指标

①骨关节炎膝关节软骨-骨交界的组织学变化；②骨关节炎膝关节软骨下骨板及软骨下骨松质的骨矿化密度相关参数；③骨关节炎膝关节软骨下骨中骨细胞的形态学改变。

来源：中国组织工程研究,,26(11):-