高效液相色谱中梯度方法观察到的鬼峰有许多可能的原因，然而几乎总有一个共同的机制即：当流动相具有较高的洗脱强度时，流动相中有紫外吸收的有机杂质在柱上聚焦成组分带，并随后在梯度中洗脱。这些流动相杂质的潜在“来源”是广泛的。鬼峰的其他原因包括流动相输送的物理或机械方面、样品引入和固定相效应。色谱图可能包含来自各种来源的鬼峰，这使得鬼峰问题的整体解决非常困难。
在下面的讨论中，更详细地说明了杂质聚焦机理，并讨论了一些新的和以前公认的原因以及识别和修复鬼峰问题的技巧。
流动相污染与能带压缩机制
在所有色谱中，纵向扩散会增加分离组分的带宽。在等度色谱高效液相色谱中，人们试图在纵向扩散变得不可控制和峰太宽之前洗脱组分。在梯度洗脱色谱中，存在动态压缩组分带的主动聚焦机制(带/峰压缩)。梯度高效液相色谱运行中观察到的峰宽是同步扩散和聚焦过程的产物。在线性溶剂梯度中，峰宽在整个过程中应该近似恒定。
聚焦机制可以合理化如下：想象一个组分带广泛扩散在高效液相色谱柱的顶部。当施加溶剂梯度时，带后部的有机溶剂浓度总是高于带前部。因此，带前的组分分子比带后的组分分子更强地被固定相保留。因此，带后的成分分子总是更快移动，任何落后的会被更强的洗脱液聚集，并更快地向前移动以赶上其余的。假设柱足够长并且梯度足够陡，峰值聚焦(或压缩)逐渐发展的扩散和聚焦过程的平衡决定最终峰值宽度的程度，如下图所示。纵向扩散通过使用较小直径的球形颗粒而最小化，例如3μm而不是5μm的二氧化硅。通过增加梯度陡度，频带压缩机制被最大化。
图1组分带通过提高洗脱强度的溶剂梯度被压缩的示意图
带聚焦机制可以类似地聚焦流动相中存在的有机杂质。在低洗脱剂浓度下表现出一定保留的杂质可能会随着梯度的进行而聚集成峰。同样的“痕量富集”机制被用于环境分析，其中农药和有机残留物从大量含水样品中装载到柱上，然后用聚焦溶剂梯度洗脱。在充分聚焦后，流动相鬼峰似乎与注入的分析物峰相同，然而，当聚焦不完全时，它们可能更宽或具有非典型形状。
图2为加入邻苯二甲酸二辛酯的流动相色谱图，显示了如何通过聚焦机制，在空白梯度运行中可以观察到流动相中约1纳克/毫升水平的杂质。尽管邻苯二甲酸二辛酯鬼峰很小，但它仍可能干扰药物分析中低水平有机杂质的定量。
理想的梯度HPLC流动相到达顶部该柱应仅包含预期的溶剂和试剂，绝对不包含其他任何物质。梯度高效液相色谱不是只分析样品，也分析流动相的杂质和仪器路径的溶剂。为了区分真实的分析物峰和这些系统(或鬼)峰，空白进样的检查是必不可少的。
图2为加入邻苯二甲酸二辛酯的流动相色谱图
1、水
用于梯度高效液相色谱的水必须尽可能纯净和新鲜。理想情况下，它应该不含微量有机物、无机物和微粒。幸运的是，对于忙碌的药物分析员来说，商业上可获得的设备可以满足实验室的需要，因此水不应该是一个问题，然而，为了获得好的结果，这些净化器系统必须被设置和保持在高标准。Milli-Q和ElgaMaxima是能够提供这种质量的系统。这些系统的主要部件首先是重活性炭和5μm预滤器(去除颗粒并将氯含量降低到亚克/毫升水平)、反渗透装置(去除大部分离子种类)和紫外线光氧化以杀死细菌和氧化有机种类。使用离子交换和碳吸附介质进一步降低无机和有机含量，并使用超微滤单元(0.05um)，最终去除细菌和细颗粒。系统应定期消毒和更换耗材。间歇循环还应定期重新净化系统中的水。
图3清洁和污染的梯度洗脱色谱的比较。
图3显示了梯度HPLC对水质的敏感性。表示使用75％甲醇的“梯度”的药物相关物质方法，45分钟后甲醇升高至90％。上面的基线是相同的方法表现出严重的梯度鬼峰，使得分析无用。污染物在第一个等度周期结束时开始突破，最终随着洗脱液浓度的增加而被洗掉。这种严重系统污染的原因尚未完全确认，但强烈怀疑是由于一个被忽视和细菌感染的净水器系统造成的。杂质的保留范围非常广，与细菌污染产生的各种物质相当。当细菌被破坏时，它们的聚合分泌物和脂多糖细胞碎片仍保留在水中，这可能包括不容易通过吸附方法去除的极性物质。如果长时间连续使用高含水溶剂，细菌的“生物膜”可能会在仪器和管道内形成。高效液相色谱溶剂入口过滤器应定期更换或彻底清洗，因为这些过滤器的高表面积使其成为细菌的“迷宫般的避难所”。用纯甲醇或乙腈定期冲洗高含水溶剂管线将有助于限制微生物生长，用二氯甲烷进一步冲洗将完全去除系统中的任何脂质和油脂。
遇到的主要生物是革兰氏阴性菌(例如假单胞菌属)。)它可以在纯水中生存和生长，并在磷酸盐或醋酸盐等的存在下茁壮成长。它们在20-35℃下快速生长，只需几天就能在高效液相色谱洗脱液中检测到。低温储存会显著降低生长，但冷藏高效液相色谱洗脱液通常并不实用。贝里已经表明，即使pH9缓冲液也不足以阻止生长。
我们自己的微生物学家建议使用至少15%甲醇的混合物来抑制细菌生长，其他人建议使用至少5%甲醇或乙腈。贝里曾提到使用0.04%(重量/体积)和0.%(重量/体积)之间的叠氮化钠作为水缓冲液中的抗菌剂，尽管由于储备溶液易于分解，多兰曾描述过制备0.%(重量/体积)(0.4克在10升水洗脱液中)以便在低至纳米的检测波长下有效使用。有些细菌对二氧化氯、季铵化合物和0.25%乙酸有抵抗力。通常，它们可以适应恶劣的条件，因此流动相玻璃器皿应该定期用有机溶剂清洗并完全干燥，而不是例行地用洗脱液“加满”。
细菌鬼峰问题的其他例子包括在高效液相色谱泵“密封-清洗”溶液中出现细菌生长情况。50:50乙腈：水密封清洗溶液的有机含量因蒸发而降低，随后细菌生长。用新鲜混合物替换“轻微混浊”的密封清洗溶液，可以完全去除色谱中的鬼峰。此外，绝不能使用实验室洗瓶来补充高效液相色谱洗脱液的水量。这种水不仅会被洗瓶塑料的提取物浸透，而且微生物的繁殖旺盛。
笔者也曾经遇到水产生鬼峰的例子。在与工厂进行分析方法转移时，有关物质的基线峰出现巨大干扰，(见下两图)，经排查后发现正常的基线图谱为娃哈哈纯净水，工厂采用车间自己生产的注射用水，取来后放置了两天，导致出现异常。
2、水中的无机杂质
现代反相高效液相色谱柱使用超纯(B类：酸洗或C类：:合成)二氧化硅，其痕量金属离子非常低。色谱柱的性能取决于保持这种低金属离子含量。用于梯度高效液相色谱的水必须完全去离子和纯化，这不仅是为了色谱柱，也是因为离子含量会对梯度基线产生影响。图4显示了去离子水和纯净水不足如何影响梯度基线的斜率。无保留的紫外吸收阴离子(如亚硝酸盐、硝酸盐)最有可能是吸光度变化的原因。
图4梯度基线是用ElgaMaxima净化后的水和(2)单独反渗透净化的水获得的。
3、有机溶剂
正如多兰建议有机溶剂中的杂质会集中在反相高效液相色谱柱上，然后通过痕量富集和聚焦机制洗脱，这似乎不合逻辑。然而，必须记住，在梯度的早期，溶剂混合物具有相对较低的总洗脱强度，因此来自有机溶剂的杂质仍然可以以相同的方式保留和洗脱。事实上，已经表明，一些杂质可以被80%的有机物强烈保留，并且在90-%有机物时作为鬼峰洗脱。认识到这一点后，我们才认为有机溶剂质量是一个重要问题。事实上，不同供应商之间，甚至产品批次之间的质量差异可能非常大。图5说明了我们在供应梯度级甲醇时遇到的一个问题。
特定甲醇批次的两个独立瓶给出空白梯度色谱图，显示严重污染的上痕量。然而，五个不同批次的甲醇给出了干净的空白，如较低的痕量所示；所有其他色谱条件都相同。当时，供应商自己对污染批次的质量控制测试实际上表明它是干净的，尽管测试程序是合适的，但批次污染发生在测试后的某个时间，大概是在装瓶过程中。自该事件以来，供应商实施了改进的制造和质量保证控制，以防止再次发生事故。然而，这个例子说明了梯度液相色谱对商业供应材料质量的敏感性。除非供应商意识到微量污染的问题，并且有一些有效的方法来防止不合适的产品单元到达消费者手中，否则劣质材料批次可能仍然会有。
图5受污染和清洁的甲醇批次的比较图
布里斯托尔描述了一种高效液相色谱方法，用于区分鬼峰是来自水还是二元体系的有机溶剂。为了评估源自水性组分的杂质，必须将不同体积的%水(或水性缓冲液)加载到柱上然后运行一个梯度，寻找鬼峰高度的增加。如果装载90%的水和10%的有机溶剂，平衡时间加倍会使两种溶剂的杂质装载加倍，没有给出有用的信息。通过首先用10%有机洗脱液平衡系统，然后用30%有机洗脱液平衡系统后获得的梯度色谱图，可以突出有机溶剂的鬼峰。源自有机溶剂的鬼峰在从30%有机物开始的梯度中将更大。鬼峰尺寸的增加不是直接成比例的，因为杂质负载在梯度的早期也在一定程度上发生(见图7)。
图7测定水和乙腈中杂质引起的洗脱液鬼峰的来源
标记为“溶剂畸变”的峰来自于将乙腈引入纯水系统所引起的物理混合效应(或除气作用，见下文)。该峰形状不典型，其面积不会随%水的额外负荷而变化；其他水杂质峰的尺寸加倍。这些色谱图中有趣的特征是，一般来说，源于水的鬼峰往往出现在色谱图的早期，而源于有机溶剂的鬼峰往往出现在后期。同样值得注意的是，30%有机物的起始混合物具有0%或10%起始条件更平滑的基线，因为混合物已经太强而不能有效地聚焦更亲水的水杂质。
备注：笔者在实际过程会经常遇到各个有机溶剂供应商之间的差异，在进行分析方法开发或者方法转移时都需要