学士学位论文
题目名称：蓝莓授粉受精及胚胎发育过程观察
学生姓名：陈贞洁
院系：园艺专业年级：级园艺
指导教师：王颖职称：副教授
年6月10日
摘要：以‘北陆’为母本‘美登’为父本进行杂交，利用荧光显微镜观察，激光共聚焦显微镜成像与常规石蜡切片观察获得蓝莓的授粉受精过程。结果表明：蓝莓花粉在授粉后至2h均有萌发；8h后存在花粉管进入子房的情况；10h左右精子进入胚珠；72h后精子与卵细胞融合形成合子，两个极核同时也进行融合；自花粉管进入花柱至合子形成期间，助细胞逐渐退化并消失，反足细胞退化，融合的极核与合子向胚珠内两极靠近。由于花粉萌发时间不同，子房内胚珠的受精情况也不尽相同，对结果存在一定的影响。授粉后h合子发育成球形胚；授粉后16～31d，胚胎发育经历了鱼雷胚→心形胚→子叶胚(成熟胚)的形态发育阶段。本研究为远缘杂交、育种工作以及蓝莓的栽培生产提供一定的科学依据。
关键词：蓝莓；授粉；受精；荧光显微镜；石蜡切片
Observationonpollinationandembryodevelopmentofblueberry
Name:ChenZhenjie
Major:Horticulture
Tutor:WangYing
Abstract:Thehybridizationofthenortheastwastakenasthemaleparent,andthepollinationandfertilizationprocessoftheblueberrywasobtainedbyfluorescencemicroscopy,laserconfocalmicroscopyimagingandconventionalparaffinsectionobservation.Theresultsshowedthatthepollenofblueberrypollenwasgerminated2hoursafterpollination;thepollentubeenteredtheovaryafter8h;thespermenteredtheovulearound10h;thespermandeggcellsmergedtoformthezygoteatthesametimeandthetwopolarnucleimerged;Duringtheformationofthestyletothezygote,thehelpercellsgraduallydegenerateanddisappear,theantipodalcellsdegenerate,andthefusedpolarnucleiandzygotesapproachthetwoendsoftheovule.Duetodifferentpollengerminationtime,thefertilizationofovulesintheovaryisnotthesame,andtheresultshaveacertainimpact.Thezygotedevelopedintoaglobularembryohafterpollination;16~31dafterpollination,theembryonicdevelopmentexperiencedthemorphologicaldevelopmentstageofthetorpedo-heart-embryo-cotembryo(matureembryo).Whichprovidesascientificbasisfordistanthybridization,breedingworkandcultivationandproductionofblueberries.
Keywords:blueberry;pollination;fertilization;laserconfocalmicroscopy;paraffinsection
1.前言
1.1蓝莓的概述
1.2双受精现象及胚胎发育研究进展
1.3蓝莓授粉受精过程及胚胎发育研究进展
2.材料与方法
2.1材料与处理
题目I
摘要及关键词I
1.前言1
1.1蓝莓的概述1
1.2双受精现象及胚胎发育研究进展1
1.2.1石蜡切片技术1
1.2.2激光扫描共聚焦荧光显微镜1
1.3蓝莓授粉受精过程及胚胎发育研究进展2
1.4目的意义2
2.材料与方法2
2.1材料与处理2
2.2方法2
2.2.1取样、固定和保存2
2.2.2常规石蜡切片法2
2.2.3荧光显微镜观察3
3.结果与分析3
3.1授粉后花粉管生长及受精过程3
3.2胚胎发育4
4.讨论5
5.结论6
参考文献6
致谢8
2.2方法
2.2.1取样、固定和保存
共取样20次。授粉后2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、72h、h取样，每次采集20个样本，授粉h后每隔五天取一次样，每次采集10个样本，直到果实成熟。样本采集后放于玻璃小瓶中，加入FAA固定液（70%酒精+冰醋酸+丙三醇+38%甲醛=90:5:5:5）固定，塞上盖子，抽取瓶内气体，用封口膜封口保存。
2.2.2常规石蜡切片法
2.2.2.1脱水、透明
用乙醇进行梯度脱水：75%（1.5h）-85%（1.5h）-95%（1.5h）-无水乙醇（两次，每次35min）。将脱水后的材料再转入无水乙醇与二甲苯混合液中进行逐级透明，无水乙醇：二甲苯=2:1-1:1-1:2，最后将转移到纯二甲苯中，每级透明时间为1.5h。
2.2.2.2透蜡、包埋
加入1/2体积融点为60～62℃的石蜡屑，放入37℃恒温箱中过夜，然后换成已融化的纯石蜡，共换三次纯石蜡，置于65℃恒温箱中，每次透蜡的时间不低于2h。透蜡后将材料和融化的石蜡一起倒入用硫酸纸折成的纸盒中，待蜡块冷却凝固。
2.2.2.3切片、粘片、展片
将包埋好的蜡块修成上小下大的梯形，固定在樟木块上，然后用上海医疗机械四厂-1型手摇式切片机进行切片，1～12次的样本切片厚度为8～10μm，13～20次的样本切片厚度为20μm。在粘片时，先在载玻片上涂一层粘贴剂（明胶1g+丙三醇15mL+酚2g+蒸馏水mL），再滴加蒸馏水，将切好的蜡带光面朝下，放在载玻片上并置于40℃的温台上加热使蜡片展开，随后将展开的蜡片放入烘箱中35℃烘干。
2.2.2.4染色、封片、观察
脱蜡、复水后用番红-固绿染色法（1%番红的乙醇溶液-0.1%固绿的乙醇溶液）复染，用加拿大中性树胶对切片进行密封后将切片放在光学显微镜下进行观察。
2.2.3荧光显微镜观察
取2～72h样本进行激光共聚焦前处理：复水，0.1%曙红（1g曙红+4%蔗糖水溶液）染色数小时后观察。将样品再次复水后放入0.1moL/LNaOH溶液中,60℃水浴加热软化40min,压片，在荧光显微镜下观察花粉管的生长状态。
3.结果与分析
3.1授粉后花粉管生长及受精过程
花粉管的伸长速度在生长初期较快，在花粉管延伸至底部后伸长速度有所降低。授粉后至2h内已有花粉萌发，且花粉管已经开始向中空花柱道伸长并已延伸至花柱三分之一处（图1-a）；授粉后4h，大多数花粉管都已延伸到花柱的三分之二处（图1-b）；授粉后6h，花粉管到达花柱基部，未进入子房（图1-c）；授粉后8h，花粉管已进入子房内部（图1-d）。授粉后10h可观察到花粉管已穿过珠孔进入胚珠（图1-e）。花粉管在授粉后24h已经进入胚囊中（图1-f），精子与卵细胞在授粉后72h融合形成合子，同时两个极核与另一个精子也进行融合（图2-b）。自花粉管进入花柱至合子形成期间，助细胞逐渐退化消失，反足细胞退化，融合的极核与合子向胚珠内两极靠近（图2-c）。
3.2胚胎发育
合子分裂后，胚囊体积逐渐扩大，授粉后h，胚体扩大成圆球形，称为球形胚（图1-g）；球形胚的顶端中间部分生长缓慢，两侧的组织生长较快，因此中间部分向内逐步形成凹陷，两侧则形成突起，并发育形成两片子叶原基，子叶原基进一步会发育成子叶，同时下端的胚根和胚轴部分也会相应生长伸长，此时的胚体形似鱼雷，称为鱼雷胚（图1-h）；胚体在中间凹陷处的顶端部分有顶端分生组织，发育形成根端分生组织，胚体发育变化成心形胚（图1-i）；之后，子叶凹陷部分逐渐分化出胚芽，在胚芽的另一端形成胚根，子叶两端突起，继续生长、伸长、膨大（图1-j）；在授粉后31d后的种子的横切图片可观察到子叶已扩大，几乎充满了整个种子，胚乳在胚胎发育过程中逐渐退化消失。此时的弯曲的子叶对折包住胚根，此时的胚胎已发育成熟，称为子叶期（图1-k）。
在观察胚胎发育过程中存在胚胎发育异常的现象，如空胚囊（图1-l）和胚胎发育停滞（图1-m）。
图1石蜡切片观察授粉受精及胚胎发育过程
a.授粉后2h，花粉管位于花柱上部（×）；b.授粉后4h，花粉管（×）；
c.授粉后6h，花粉管位于花柱基部（×）；d.授粉后8h（×）；e.授粉后10h（×）；
f.授粉后24h（×）；g.授粉后h，球形胚（×）；h.授粉后16d，顶端向内凹陷（×）；
i.授粉后21d，心形胚（×）；j.授粉后26d，子叶伸长（×）；k.授粉后31d，胚胎发育成熟（×）；l.授粉后h，空胚囊（×）；m.授粉后10d（×），球形胚停止发育
Figure1Paraffinsectionobservationpollinationfertilizationandembryodevelopment
a.2hoursafterpollination,thepollentubeislocatedintheupperpartofthestyle(×);
b.4hoursafterpollination,pollentube(×);
c.6hoursafterpollination,thepollentubeislocatedatthebaseofthestyle(×);
d.After8h(×);e.10hafterpollination(×);f.24hafterpollination(×);
g.hafterpollination,globularembryo(×);h.16dafterpollination,topinwarddepression(×);
i.21dafterpollination,heart-shapedembryo(×);j.26dafterpollination,cotyledonelongation(×);k.31dafterpollination,embryonicdevelopment(×);l.Afterh,emptyembryosac(×);
m.10dafterpollination(×),globularembryosstopdeveloping
图2荧光显微观察受精过程
a.授粉后4h，胚囊；b.授粉后72h，形成合子，两个极核融合；
c.授粉后72h，助细胞与反足细胞退化消失，融合的极核与合子向胚珠内两极靠近
Figure2fluorescencemicroscopetoobservethefertilizationprocess
a.4hoursafterpollination,embryosac;b.72hafterpollination,zygoteformation,twopolarnucleusfusion;c.72hafterpollination,helpercellsandantipodalcellsdisappeared,fusedpolarandzygoteintoovuleTwopolesclose
4.讨论
花粉管是花粉在柱头上萌发后形成的，花粉管穿过花柱到达子房完成受精所经历的时间一般在10～48h之间[11,12]。‘密斯蒂’蓝莓自花授粉与异花授粉的花粉均在8h后开始在柱头萌发,花粉管通过花柱到达子房的整个过程所经历的时间基本符合这个规律[13]。在本试验中，‘北陆’在2h内就已经有花粉萌发，并存在花粉管向花柱内延伸的现象，直至授粉后72h完成受精过程，与‘密斯蒂’相比较，花粉萌发较早，受精过程相对延迟。可能由于在授粉后出现了阴雨天，受环境因素的影响，花粉萌发后进入胚珠受精过程的延迟，也可能是由于不同蓝莓品种间存在差异而导致受精过程的延迟。
在本试验中，双受精完成后，胚胎形态发育经过受精卵、球形胚、鱼雷胚、心形胚和子叶胚阶段，与猕猴桃[14]、枣[15]、桃[16]、板栗[17]的胚胎形态发育阶段基本相同。
在本试验中，空胚囊和胚胎发育停滞的现象出现在胚胎发育过程中。蓝莓不同品种间授粉的亲和性较差[18],当花粉管穿过珠孔进入胚珠时，卵和极核可能已经不处于受精的最佳时期，此时容易产生败育现象。且蓝莓有花粉直感现象[19]，在胚胎发育过程中出现空胚囊，可能是受父本花粉的影响，出现受精不良的情况，从而导致未受精胚珠的胚囊解体，出现空胚囊的现象。胚胎发育停止可能因存在一些胚乳分裂异常的现象,如无核葡萄的胚败育原因[20],结果导致胚胎营养供应不足,从而导胚胎停止发育或发育异常。此外，同一花蕾中不同胚珠受精不一致会导致子房中胚胎发育进程不一致，较晚受精的胚胎因营养和内源激素亏缺而导致胚胎无法继续发育[21]。
5.结论
花粉管前期的生长速度快，授粉后2h花粉管便延伸至花柱三分之一处，8h后进入子房，双受精在72h内就已经完成。在此之后，合子开始分裂，胚胎发育经球形胚、鱼雷胚、心形胚和成熟胚四个形态变化阶段。在胚胎发育期间还存在空胚囊和胚胎发育停滞的异常现象。
参考文献
[1]吴林.中国蓝莓35年——科学研究与产业发展[J].吉林农业大学学报,,38(01):1-11.
[2]任艳玲,周杰,王涛等.贵州蓝莓产业的发展现状及对策[J].贵州农业科学,,44(06):-.
[3]刘庆忠,朱东姿,王甲威等.世界蓝莓产业发展现状——中国篇[J].落叶果树,,50(06):1-4.
[4]DarioJC.PaulML.EffectsofSelf-pollinationandCross-pollinationofVacciniumdarrowiiEricaceae)andOtherLow-chillBlueberries[J].Hortscience,,44(6):-.
[5]李亚东,裴嘉博,孙海悦.全球蓝莓产业发展现状及展望[J].吉林农业大学学报,,40(04):-.
[6]刘欢.‘浆果之王’蓝莓的营养保健作用研究[J].中国新技术新产品,(19):.
致谢
首先，我要感谢我的导师-王颖老师，王颖老师在实验设计上提供了思路和许多指导性意见，这些实验操作技能和经验对我来说是一笔非常宝贵的财富。除了实验，在学习和未来规划方面，老师也给我们分享了许多的自身经验，也提出了一些意见和建议，真的非常感激老师的帮助和关怀。
我要感谢葛春梅师姐，在实验过程中，葛春梅师姐给我们提供了很多的帮助，也为我们解决不少的难题，还经常陪我们做实验，很感谢师姐的帮助和支持。
最后，我要感谢一直支持我，鼓励我、关怀的父母和亲人们，感谢他们一直以来辛苦付出和在远方的关心。
我还要感谢同一个课题组的同学们，在这段时间里我们相互帮忙，一起努力，共同进步。